白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物信息学分析

目的应用简并引物RT．PCR和RACE方法获取白纹伊蚊Rh类糖蛋白（Aedes albopictus rhesuslike glycoprotein,AaRh）基因的全长cDNA。方法根据冈比亚按蚊、埃及伊蚊等亲缘关系较近物种的Rh类糖蛋白同源性分析结果,在氨基酸高度保守区域184／343和219／337氨基酸位点设计2对简并引物,以白纹伊蚊雌蚊总RNA为模板,应用巢式RT—PCR扩增AaRh的基因片段。根据获得的AaRh基因部分序列,设计2对特异性引物AaRhGSP1、GSP2和AaRhGSP3、GSP4,应用5’RACE和3’RACE分别扩增AaRh基因的5’端和3’端cDNA片段,然后拼接出全长cDNA序列。通过在线生物信息学分析（NCBI和Expasy）,对目的基因序列进行生物信息学分析。结果应用2对简并引物进行巢式RT-PCR．获得379bpAaRh基因片段。应用5’RACE和3’RACE方法,分别获得AaRh基因5’端1008bp、3’端822bpcDNA序列,根据两个片段的首／尾共同序列拼接为1717bp的基因片段。该核苷酸序列经BLASTn分析显示,与埃及伊蚊Rh蛋白的一致性高达95％,鉴定其为白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因。AaRh基因具有完整的开放阅读框,其ORF从第128位到1516位含1389bp,编码462个氨基酸。Expasy在线生物信息学程序分析显示,白纹伊蚊Rh类糖蛋白是一个整合膜蛋白,跨膜11次,58aa．446aa具有铵离子通道的结构功能域;理论等电点（pI）5．37,分子量49775．10Mr,laa-26aa可能为分泌信号肽序列;含有4个潜在的天冬酰胺糖基化位点和17个线性抗原决定簇,翻译后可能进行糖基化修饰,提示其为糖蛋白。结论成功获取AaRh基因的全长cDNA,生物信息学分析结果为AaRh蛋白的生物学特性和功能研究奠定了基础。     

白纹伊蚊β-肌动蛋白实时定量PCR方法的建立与分析

采用T-A克隆技术,在白纹伊蚊β-肌动蛋白的基因序列上设计引物,PCR扩增后将特异性产物连入T载体中,提取质粒,经测序分析验证后,测定浓度,稀释获得标准品,采用SYBR green法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线,作为白纹伊蚊各种基因实时定量PCR检测中的内参照物.结果表明：利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系（斜率为-3.3287,R2=0.9980）;实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在83℃±0.5℃的PCR产物是白纹伊蚊肌动蛋白序列上的特异性产物,表明此标准品是白纹伊蚊肌动蛋白特异性的.本实验成功建立白纹伊蚊β-actin基因实时定量PCR方法,可作为内参照物运用于白纹伊蚊基因差异表达的研究.     

白纹伊蚊气味受体基因OR21α的克隆及定量分析

本文克隆白蚊伊蚊气味受体基因OR21a分析其是否与搜寻宿主或吸血行为相关。通过设计简并引物,PCR扩增得到白纹伊蚊气味受体基因OR21a段,采用SYBR荧光定量PCR方法,以自纹伊蚊β-肌动蛋白基因作为内参,比较了OR21a因在未吸血雌蚊、雄蚊、打断吸血雌蚊和饱血雌蚊头部表达量的差异。结果显示,白纹伊蚊OR21a因在未吸血雌蚊头部表达量最高,饱血雌蚊头部表达量最低,而在雄蚊头部的表达量介于打断吸血雌蚊和饱血雌蚊之间。本研究发现白蚊伊蚊会依据不同的生理需求改变OR21a因的表达量,推测可能与白纹伊蚊搜寻宿主及吸血行为有一定的相关性。     

白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析

根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的 5′ 末端核苷酸序列 ,设计 2个反向特异引物 (GSP1和GSP2 ) ,利用 4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA ,消化产物与适配子连接产生 4种消化的DNA库 ,并分别以此为模板 ,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第 1步PCR扩增 ,然后再以第 1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第 2次PCR扩增。将扩增产物进行T A克隆及测序。结果显示 :分别以DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ消化的DNA库为模板而获得 4个长短不一的DNA序列 :80 6bp、 2 190bp、 3 0 76bp和 2 2 0 6bp ,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′ 非翻译区序列及氨基端开头 10个氨基酸的编码序列 ;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和 或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件。表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因 4个上游启动子区序列 ,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P45 0基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用     

白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析

根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库,并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.将扩增产物进行T-A克隆及测序.结果显示分别以Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ消化的DNA库为模板而获得4个长短不一的DNA序列806bp、2 190bp、3 076bp和2 206bp,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′-非翻译区序列及氨基端开头10个氨基酸的编码序列;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和/或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件.表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因4个上游启动子区序列,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P450基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用.     

日本沼虾酚氧化酶原基因cDNA的全长克隆及表达分析 

目的 克隆日本沼虾酚氧化酶原（proPO）基因,进行生物信息学及时空表达分析。方法 利用RT-PCR和快速扩增cDNA末端（RACE）技术从血细胞中克隆proPO基因cDNA全长序列,用生物软件对其序列进行生物信息学分析; proPO基因时空表达分析采用RT-PCR和Real-time PCR方法;腹部肌肉注射嗜水气单胞菌（5.0×10SUP>9/SUP>/L）诱导酚氧化酶（PO）,20μl/只,注射后3、6、12、24h取其血淋巴,分别测定血细胞 proPO mRNA水平及血清酚氧化酶（PO）活力。结果 日本沼虾proPO基因cDNA全长2428bp,包含71 bp的 5’UTR、344 bp的 3’UTR 和2013 bp的开放阅读框（ORF）。ORF编码 671 个氨基酸,预测蛋白分子量为76.5kD,理论等电点（pI）约为7.31;含有2个保守的铜离子结合位点和6个组氨酸残基、1个蛋白酶水解位点和硫酯样的基序(GCGWPRHM);含有3个血蓝蛋白结构域;与罗氏沼虾proPO的相似性最高,为93%,与其他甲壳动物proPO相似     

广州地区白纹伊蚊体内登革病毒的检测

目的了解广州地区登革热传播媒介白纹伊蚊携带登革病毒的情况，为登革热预防控制提供预测预警信息。方法从广州11个行政区及其登革热旧疫点捕获白纹伊蚊成蚊和幼虫（经实验室培育羽化成成蚊），提取登革病毒RNA，One step SYBR Green I实时RT-PCR进行检测。结果2005—2007年从广州地区采集的493批白纹伊蚊（6255只）中，共检测出两份阳性结果，分别来自登革热疫点和旧疫点，经测序证实为登革I型．其余为阴性。最低感染率为0．32。结论本文白纹伊蚊携带登革病毒比率较低，可能与登革病毒在蚊体内传代的递减效应、采样时间滞后以及广州登革热非连续性爆发有关。     

广州地区白纹伊蚊自然种群幼虫密度指数变动及其影响因素

目的掌握本地区白纹伊蚊自然种群幼虫密度指数变动规律及其影响因素,为白纹伊蚊自然种群变动的预测预报提供依据。方法对广州市不同生境的白纹伊蚊幼虫密度进行全年监测及调查,对幼虫密度变动规律及其与气候、环境的相关性进行分析。结果在广州地区,白纹伊蚊幼虫在全年各月份均发育繁殖,幼虫密度高峰主要分布于5～8月份,其密度变动与气温、雨量和孳生地环境状况有关。气温是影响白纹伊蚊种群密度变动的主要因素,而雨量对白纹伊蚊幼虫密度消长的影响程度取决于白纹伊蚊孳生地在不同环境分布。结论广州地区白纹伊蚊自然种群幼虫密度变动规律与气候因素和孳生地分布环境有关,分析白纹伊蚊幼虫密度的变动规律及其影响因素对建立白纹伊蚊种群预测预报模型具有重要意义。     

广州地区白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性的初步研究

目的初步了解广州地区白纹伊蚊对常用杀虫剂的抗药性水平,为控制登革热媒介科学合理用药提供依据。方法从广州地区三种环境类型（农村、郊区、城区）采集白纹伊蚊幼虫,实验室繁殖1—2代,采用WHO推荐的生物测试法进行测定。结果广州农村地区白纹伊蚊对溴氰菊酯、高效氯氰菊酯的抗药性指数分别为4．95、2．41,已产生低抗性;城区、郊区白纹伊蚊对敌敌畏有低抗性,抗药性指数分别为2．16、3．45;三种环境类型白纹伊蚊均对倍硫磷、氯菊酯、残杀威敏感。结论广州地区不同环境类型白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性有差异．应因地制宜。科学合理使用杀虫剂。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系生物学特性及可溶性蛋白的研究

在实验室条件下观察白纹伊蚊溴氰菊酯敏感品系与抗性品系的生物学特性,并对两品系的Ⅳ龄幼虫和成蚊的可溶性蛋白提取物进行SDS-PAGE分析.结果表明:与敏感品系比较,抗性品系的幼虫化蛹率明显提高,但羽化率无显著性差异.SDS-PAGE分析表明两品系的Ⅳ龄幼虫与成蚊蛋白条带均有明显区别:成蚊有分子量约为200 kDa的特异性...     

2008-2010年广州市自然界白纹伊蚊携带登革病毒监测

目的通过对广州地区登革热媒介蚊虫白纹伊蚊携带登革病毒情况的监测,探讨传播媒介对该地区登革热流行特征的影响。方法采集广州市各区新旧疫点附近的白纹伊蚊幼虫及成蚊,提取蚊虫总RNA,用登革病毒特异引物经实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行病毒核酸检测。结果 2008年以来共检测白纹伊蚊标本658批,合计12348只,平均每批检测18.8只蚊虫,未检测出登革病毒核酸。结论广州地区白纹伊蚊自然种群携带登革病毒水平较低。     

广东省佛山市某镇白纹伊蚊密度季节消长情况调查分析

目的了解和掌握佛山市某镇白纹伊蚊的季节消长情况,为当地开展登革热防控工作提供依据。方法用诱捕器进行4d为一周期的成蚊诱捕以及诱卵现场实验,并根据季节的诱捕结果估算白纹伊蚊的密度消长情况。结果 2008年秋季至2009年夏季,4次实验共捕获成蚊282只,包括白纹伊蚊161只;收集蚊卵5954个。实验结果显示四个季度之间蚊媒密度的差异具有统计学意义。其中,诱蚊诱卵指数（MOI）（χ2=52.172,P〈0.000）,诱蚊指数（MI）（χ2=47.664,P〈0.000）,诱卵指数（OI）（χ2=44.525,P〈0.000）,诱蚊密度指数（MDI）（F=17.448,P〈0.000）,蚊卵密度指数（EDI）（F=13.454,P〈0.000）。结论当地白纹伊蚊夏秋两季的阳性指数与密度指数均比冬春两季高且差异具有统计学意义。其中,夏末秋初是蚊媒密度的高峰。本次实验结果与传统监测指标所反映的密度变化趋势一致。     

广州地区农村登革热旧疫点白纹伊蚊密度消长特点分析

目的探索广州农村登革热旧疫点白纹伊蚊密度特点及消长规律。方法在农村设立监测点对自然环境中白纹伊蚊幼虫及成蚊密度进行长期连续监测。结果农村中白纹伊蚊幼虫孳生地以室外环境为主,全年皆可在积水容器中检出幼虫,白纹伊蚊幼虫和成蚊密度消长与季节密切相关。结论以室外孳生地为主的农村地区白纹伊蚊种群易受气候因素影响,幼虫密度高峰与成蚊密度高峰之间存在一定的时间差,其规律性有待于进一步研究。     

登革病毒感染对白纹伊蚊生理生态特性的影响

目的了解登革病毒感染对白纹伊蚊生理、生态以及对杀虫剂敏感性的影响。方法观察比较通过胸腔接种方式人工感染登革病毒的白纹伊蚊和胸腔注射生理盐水的对照组蚊虫的死亡率、产卵量、孵化率、子代发育情况,以及对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性。结果两组蚊虫在死亡率、存活时间、产卵量等方面的差异有统计学意义,其它方面的差异不显著。结论登革病毒感染能够增加白纹伊蚊的死亡率并降低蚊虫的产卵能力。     

诱蚊诱卵器不同指标在白纹伊蚊种群动态研究中的应用

为了研究诱蚊诱卵器的不同指标在不同孳生地状态的白纹伊蚊Aedes albopictus种群动态研究中的应用效果,2006年在上海市共青森林公园（试验区）和内燃机研究所（对照区）进行实验研究。试验中试验区采用各种方法清除孳生地,对照区不采取任何措施。采用诱卵阳性率,诱卵器平均卵数,诱蚊阳性率记录白纹伊蚊种群动态。结果显示,诱卵阳性率和诱卵器平均卵数在对照区和试验区都有很好的相关性;相比诱卵阳性率,诱蚊阳性率灵敏度在对照区和试验区分别为78．6％和67．6％,特异度分别为96．2％和98．7％,符合率分别为90．3％和94．2％。可见诱蚊诱卵器在不同孳生地水平的场所研究白纹伊蚊种群动态最好指标都为诱卵阳性率,其诱捕成蚊功能是有效补充。