绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB／NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性：取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠,     

绿色荧光蛋白基因结合鼠Talin基因蛋白标记转基因水稻活体生殖细胞及精细胞的微丝骨架

利用绿色荧光蛋白(GFP)基因结合鼠Talin基因表达技术及水稻(Oryza sativa L.)转基因技术,筛选出表达稳定和具等位基因型的第三代转基因水稻。在其活体花粉的4个发育阶段(Ⅰ．小孢子晚期;Ⅱ．二细胞早期;Ⅲ．二细胞晚期;Ⅳ．三细胞阶段),观察了细胞内微丝骨架的分布和结构形态的变化。发现在这4个花粉发育阶段,花粉内的营养核、生殖核、生殖细胞和精细胞都在不同的发育阶段出现位移。而这些位移与微丝骨架的结构变化和运动有密切关系。在胞质中央的微丝网络以及细胞周质的网络不断变化和互动,导致营养核、生殖核或生殖细胞和精细胞的定向位移。在活体生殖细胞和精细胞内,存有一股与细胞纵轴平行排列的微丝骨架。这些微丝骨架对生殖细胞及精细胞可以提供移动的动力,这对生殖细胞或精细胞在花管内以及胚囊内的运动(包括独自游动)提供了依据。     

鸡胚早期神经系统发育中凋亡细胞的分布研究

研究鸡胚18S（Stage）神经系统发育中凋亡细胞的分布及其生物学意义。采用HNK－1和TUNEL免疫组化双染及改变切片方向的方法观察了神经管和神经嵴的凋亡细胞,结果显示：凋亡的细胞在间隔10张横向切片上呈非均匀分布,但在矢状切面凋亡细胞有节段性分布趋势。体节处连续神经嵴没有发现凋亡细胞,而体节与体节之间神经嵴迁离神经管呈游离状并有凋亡细胞,神经管腹侧面体节处间充质细胞呈现细胞凋亡节段性分布。结果表明：鸡胚早期神经系统发育中选择性发生细胞凋亡作用。     

绿色荧光蛋白及其在细胞生物研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种新型的标记蛋白,已被广泛的应用。它发出的荧光稳定,检测简单,结果真实可靠。GFP可对活细胞的生理过程进行监控,并且可以用于活细胞中蛋白质分子的定位及动力学研究。其特有的生物化学性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。     

绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞（CIK）中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达.在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质.转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列.结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础.     

绿色荧光蛋白基因结合鼠Talin基因蛋白标记转基因水稻活体生殖细胞及精细胞的微丝骨架

利用绿色荧光蛋白(GFP)基因结合鼠Talin基因表达技术及水稻(Oryza sativa L.)转基因技术,筛选出表达稳定和具等位基因型的第三代转基因水稻.在其活体花粉的4个发育阶段(Ⅰ.小孢子晚期;Ⅱ.二细胞早期;Ⅲ.二细胞晚期;Ⅳ.三细胞阶段),观察了细胞内微丝骨架的分布和结构形态的变化.发现在这4个花粉发育阶段,花粉内的营养核、生殖核、生殖细胞和精细胞都在不同的发育阶段出现位移.而这些位移与微丝骨架的结构变化和运动有密切关系.在胞质中央的微丝网络以及细胞周质的网络不断变化和互动,导致营养核、生殖核或生殖细胞和精细胞的定向位移.在活体生殖细胞和精细胞内,存有一股与细胞纵轴平行排列的微丝骨架.这些微丝骨架对生殖细胞及精细胞可以提供移动的动力,这对生殖细胞或精细胞在花管内以及胚囊内的运动(包括独自游动)提供了依据.     

活细胞的分子探针——绿色荧光蛋白

来自水母的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）,在不加外源物质的情况下,紫外光激发后,能在原核和玩具核活细胞中发绿色荧光,荧光性质稳定,突变蛋白发光效率提高,激发和发射光谱明显改变。ＧＦＰ是一种十分有用的活细胞分子探针,在基因表达调控,转基因动物研究,蛋白在细胞中功能定位,迁移变化,病原菌侵入活细胞的分子过程等诸多方面均有广泛的用途。     

绿色荧光蛋白基因在青蒿转基因芽中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因,插入到植物表达载体中,构建双ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动下的植物表达载体ｐＢＩＧＦＰ,在Ｋａｍ浓度为２０ｍｇ／Ｌ的筛选培养基上,用含有ｐＢＩＦＰ质粒的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４感染青蒿叶片,获得５个抗Ｋａｎ阳性丛生芽系。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,外源ＧＦＰ基因已整合到青蒿转基因芽Ｇ－１系的基因组中。在ＯＬＹＭＰＵＳ－ＢＨ２型荧光显微镜下,观察到转基因     

绿色荧光蛋白标记的D-氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D Ala自杀基因系统可进一步用于肿瘤的基因治疗研究     

绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)是一种能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光的蛋白。有现代生物学北斗星之美誉的它,在生物学的很多领域都有广泛应用。GFP具有荧光稳定、易于检测、表达调控简单、生物安全性好等优点,在转基因研究中的各个方面均应用颇多。就GFP在转基因研究中的应用特点及应用进展做一综述。     

增强型绿色荧光蛋白的真核表达和纯化

根据编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的开放读码框(open reading frame,ORF)设计引物,PCR方法扩增出5'端带His标签的EGF PORF,利用杆状病毒表达系统构建表达EGFP基因的重组杆状病毒DNA分子,转染sf9细胞.取细胞...     

绿色荧光蛋白与 HCV 核心蛋白的融合及在大肠杆菌中的高效表达

利用基因工程重组技术获得了绿色荧光蛋白（ｇｆｐ）基因与ＨＣＶ核心蛋白基因的嵌合体,并在大肠杆菌中高效表达了４８ｋＤａ的融合蛋白,经Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ免疫活性分析证实,融合蛋白仍具有ｃｏｒｅ抗原的三个免疫活性部位,同时用荧光显微镜观察并用荧光光度计测定了大肠直菌表达的融合蛋白的荧光光谱,结果证实,我们在大肠杆菌中表达的ＧＦＰ－ｃｏｒｅ融合蛋白既能发射易于检测的绿色荧光,又具     

乙型肝炎病毒e抗原基因与绿色荧光蛋白基因的融合及其表达

质粒pS65T含有T7启动子驱动的绿色荧光蛋白突变型gfpS65T基因,经修饰后,在其中插入乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）基因,使两基因同框成为融合基因。在大肠杆菌BL21中由于T7启动子的控制,高效表达了具有双功能（抗原性和发光性）的融合蛋白（GFP－HBeAg）。融合蛋白MW为52kDa,N端有6个组氨酸残基,因而用Ni金属螯合层析柱对融合蛋白进行了分离纯化,利用诊断HBV的ELISA试剂盒检测了融合蛋白的抗原性,在荧光显微镜下观察到了融合蛋白的绿色荧光。并探讨了用其组装成新型免疫诊断试剂的可能性。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

抗菌肽CM4与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）与抗菌肽CM4融合基因的真核表达载体。方法：采用递归PCR（rPCR）将GFP基因与CM4基因通过一段核苷酸片段连接成GFP-CM4融合基因,构建真核表达载体pcDNA3-GFP-CM4,用脂质体介导转染人K562白血病细胞,用MTT检测其活性。结果：融合基因可在K562细胞中表达,抗菌肽CM4的表达可抑制K562细胞的生长。结论：为全面了解抗菌肽的生物学活性及其在基因治疗中的可能作用提供了重要的理论依据。     

Xfect介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3高效转染Vero细胞的方法及其条件的优化

旨在用Xfect试剂介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3转染Vero细胞,以期获得转染效率较高的方法,并检测目标片段的表达,从而为进一步研究HSV-2 LAT基因及其ORF3片段的生物学功能奠定基础。用Xfect试剂介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3转染Vero细胞,48 h后观察荧光表达情况,并计算不同转染方法分别在有无血清及质粒与Xfect Polymer比例不同时的转染效率。用RT-PCR检测ORF3片段在Vero细胞中的表达。结果显示,采用贴壁转染法,在有血清及质粒与Xfect Polymer比例为5μg/2μL时转染效率较高;RT-PCR可以获得目的条带,证明ORF3片段在Vero细胞中得到表达。本试验获得的优化条件可以显著提高Xfect Polymer对Vero细胞的转染效率;以绿色荧光蛋白作为标签鉴定目的基因在细胞中表达的方法切实可行。     

芜菁原生质体的分离及绿色荧光蛋白的瞬时表达

目的：分离芜菁叶片原生质体,建立蛋白质在芜菁原生质体的瞬时表达系统。方法：以津田芜菁成叶为试材,酶解分离原生质体;通过PEG介导的转化,将编码绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中GFP的表达情况。结果：分离出大量的津田芜菁原生质体,并获得了较高的转化效率,GFP在整个原生质体中都有表达。结论：建立了津田芜菁原生质体瞬时表达系统。     

转染GFP对结肠直肠癌细胞遗传物质稳定性的影响

为探究绿色荧光蛋白(GFP)对结肠直肠癌细胞遗传物质稳定性是否存在影响,选取3种常用的结肠直肠癌细胞系HCT116,SW480,DLD-1;采用脂质体转染法把GFP转入细胞,统计几种细胞系微核、核芽的比例;分别比较各种细胞系自发微核、核芽和GFP组的差异.结果发现,HCT116细胞中对照组与GFP组的微核细胞率分别为3...     

绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达

目的:将绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)重组到胡萝卜愈伤组织细胞中,使其获得表达,为今后利用GFP基因作为植物报告基因提供条件。方法:通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体PBI1121转入到根癌农杆菌EHA105中,再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组织细胞中,经过除菌和抗性筛选后观测转化结果。结果:荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光,利用PCR法扩增出约740bp的目的基因片断。结论:GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达。     

带红色荧光蛋白靶向线粒体载体的构建与表达

选取由核表达的线粒体蛋白细胞色素C氧化亚单位Ⅷ（COX8）的前导序列为靶序列,从人胚胎肺成纤维细胞中扩增出COX8的前导序列,插入到pcDNA3．1／myc—HisA中,并将pDsRED1-n1中的红色荧光蛋白序列RFP克隆至COX8的下游,形成融合蛋白。在脂质体的介导下,将重组载体转染至肿瘤细胞中,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达及分布情况。构建的靶向线粒体的载体以及以红色荧光蛋白为报告基因的靶向线粒体的载体,经酶切、DNA序列测定,结果表明构建正确。将pcDNAmito—RFP转染到HeLa细胞的线粒体中,16h即可见散在荧光,72h达高峰,第10d开始减弱。以上结果表明成功构建了以红色荧光蛋白为报告基因的线粒体靶向的特异表达载体,在靶序列的引导下将红色荧光蛋白输入到线粒体中,为进一步对线粒体疾病的基因治疗研究提供了重要工具。