电脉冲介导荧光素酶基因转移高效率的实验研究

目的研究电脉冲介导的基因转移效率及其最佳因因转移电脉冲参数.方法用微量注射器将pcDNA3-Luc质粒100μg注射入BALB/小鼠的股四头肌,5min内在注射部位给予不同参数的电脉冲刺激,然后进行荧光素酶活性测定和组织病理切片.结果电脉冲可明显增加荧光素酶基因的表达,电脉冲组的荧光素酶活性(7.26±3.72)×107RLU/mg蛋白是单纯注射组(1.38±1.27)×104RLU/mg蛋白的5262倍(P=0.017).组织病理检查发现电脉冲刺激无严重的肌肉组织损伤.电压100V/cm波宽60ms,脉冲次数10次和频率0.75Hz是最佳的电脉冲参数.结论在最佳的电脉冲参数条件下,电脉冲介导的基因转移可获得较高的基因表达.     

电脉冲介导荧光素酶基因转移高效率的实验研究

目的 研究电脉冲介导的基因转移效率及其最佳基因转移电脉冲参数。方法 用微量注射器将pcDNA3-Luc质粒100μg注射入BALB/小鼠的股四头肌,5 min内在注射部位给予不同参数的电脉冲刺激,然后进行荧光素酶活性测定和组织病理切片。结果 电脉冲可明显增加荧光素酶基因的表达,电脉冲组的荧光素酶活性(7.26±3.72)×107 RLU/mg蛋白是单纯注射组(1.38±1.27)×104 RLU/mg蛋白的5 262倍(P=0.017)。组织病理检查发现电脉冲刺激无严重的肌肉组织损伤。电压100 V/cm,波宽60 ms,脉冲次数10次和频率0.75 Hz是最佳的电脉冲参数。结论 在最佳的电脉冲参数条件下,电脉冲介导的基因转移可获得较高的基因表达。     

受体介导的基因转移系统

目前，在非病毒的基因转穆方法中，受体介导的基因转移(receptor-mediated genetransfer，RMGT)受到特别广泛的重视，近几年来对该方法的研究逐渐深入使之成为具有潜在临床应用价值的基因转移方法。本文就RMGT系统的概况作一综述。     

受体介导TNFα基因转移的实验研究

目的检测受体介导基因转移人肿瘤坏死因子α基因的靶向性和表达效率.方法人转铁蛋白同多聚赖氨酸共价交联,盐键合成交联蛋白和外源基因质粒的超分子复合物,对表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞株进行β-半乳糖苷酶和人肿瘤坏死因子α基因转移.结果检测到外源基因表达;转染人肿瘤坏死因子α基因后细胞上清液检测到一过性人肿瘤坏死因子α活性升高.结论受体介导基因转移肯有良好的靶向性,但表达效率低.     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转移预防再狭窄的实验研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(vEGF)基因转移对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜增生的影响。方法 将颈总动脉球囊损伤的大鼠分为3组，用局部灌注法将50μl溶液注射至颈总动脉。20min后恢复血流。分别于14d和28d处死大鼠。观察vEGF基因转移对再内皮化及内膜增厚的影响。结果 与两对照组比较，动脉损伤后14d和28d时，VEGF基因转移加速血管再内皮化，减少内皮缺失区域(P＜0．05)；且显著抑制动脉损伤后新生内膜增厚(P＜0．01)。结论 重组腺病毒介导VEGF基因转移对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

电脉冲化学疗法与免疫疗法联用抗肿瘤转移的研究

采用电脉冲化学疗法与一种能分泌白细胞介素2的组织不相容性细胞联合应用抗肿瘤转移。实验结果表明,联合治疗不仅使荷瘤小鼠肺内的转移性癌结节数量比对照组明显减少(P<0.01),而且有50％的荷瘤小鼠无肺内转移性癌结节,肺转移率为50％,对照组为100％,差异有高度显著性。     

肌肉介导心钠素基因转移对肾性高血压大鼠的作用

目的：观察肌肉介导心钠素基因转移对肾性高血压大鼠的治疗作用。方法：利用基因克隆技术克隆和构建了高表达效率的人ＡＮＦ ｃＤＮＡ基因真核表达质粒,应用肌肉缝线法将质粒转移到大鼠骨骼肌中。结果：ＡＮＦ基因可以在骨骼肌中表达,并可释放人血,明显降低肾性高血压大鼠的血压,并产生利钠利尿效应,其作用可维持４￣６周。结论：应用基因缝线进行肌肉介导的基因转移,可在肌肉内有效表达效应蛋白质,且可释放入血,产生药物治     

受体介导TNFα基因转移的实验研究

目的 检测受体介导基因转移人肿瘤坏死因子α基因的靶向性和表达效率。方法 人转铁蛋白同多聚赖氨酸共价交联,盐键合成交联蛋白和外源基因质粒的超分子复合物,对表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞株进行β－半乳糖苷酶和人肿瘤坏死因子α基因转移。结果 检测到外源基因表达;转染人肿瘤坏死因子α基因后细胞上清液检测到一过性人肿瘤坏死因子α活性升高。结论 受体介导基因转移具有良好的靶向性,但表达效率低。     

精子介导基因转移建立转基因动物的研究进展及展望

精子介导基因转移技术制备转基因动物是在传统的转基因技术的基础上建立起来的一种新技术。由于该技术具有技术路线简单、操作方法简便、所需仪器设备少等优点,因而具有广泛的应用前景。本文主要介绍了精子介导基因转移制备转基因动物的基本原理、最新研究进展、目前存在的问题以及该技术的应用前景。     

基因转移方法的实验研究

将医用缝线浸于含有ｐＣＨ１１０质粒的ＰＢＳ缓冲液中，制成基因缝线，缝合于ＳＤ大鼠肝脏、肠壁、腹主动脉壁、腹肌、股四头肌等组织中，结果ｌａｃＺ基因在缝线周围组织中得以表达，说明缝线法转移基因的可行性，有效性，通用性。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子基因转移对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法携带VEGF165基因的腺病毒(Ad-VEGF165)感染PD模型大鼠纹状体后,采用大鼠旋转行为观察、免疫组织化学方法和高效液相色谱技术检测VEGF165基因转移的PD大鼠行为学变化、黑质纹状体酪氨酸羟化酶(TH)、层黏蛋白(laminin)和胶质纤维原性酸性蛋白(GFAP)的表达以及纹状体区多巴胺(DA)及代谢产物含量变化。并与重组腺病毒载体(Ad-Lacz)组及磷酸盐缓冲液(PBS)组进行比较。结果Ad-VEGF165成功感染PD大鼠并高表达目的基因和蛋白。感染Ad-VEGF165的大鼠获得行为学改善,其黑质和纹状体TH阳性细胞数和纤维密度与对侧半球的比值(0．42±0．11和0．56±0．10)高于Ad-LacZ组(0．20±0．10和0．28±0．09)和PBS组(0．22±0．13和0．24±0．08),P<0．01;纹状体区血管和胶质细胞数量均明显增多;Ad-VEGF165感染组大鼠纹状体区DA及代谢产物含量与对侧比值也高于对照组。结论Ad-VEGF基因转移能保护PD大鼠多巴胺能神经元,血管和胶质细胞的增生可能参与了VEGF对在体多巴胺能神经细胞的保护机制。     

血管新生性治疗中基因转移系统及其应用的研究进展

近年来，缺血性心血管疾病的血管新生性治疗的研究进展迅猛，本文就血管新生性治疗中基因转移载体的选择及其应用途径两方面作一综述。     

腺病毒载体转染大鼠颈动脉的实验研究

目的观察腺病毒载体转染大鼠颈动脉的有效性和外源性基因表达的时间过程。方法用ＡｄＶ５－ＣＭＶ质粒（对照组）或Ａｄｖ５－ＣＭＶ／ＬａｃＺ质粒（治疗组）转染大鼠颈动脉３０分钟。术后２、７、１４、２８、６０及９０天取被转染的颈动脉,行β－半乳糖苷酶活性测定和组织化学染色。结果对照组所有颈动脉均无β－半乳糖苷酶活性,治疗组术后２天颈动脉即有β－半乳糖苷酶的表达,７～１４天为表达高峰期,２８天后表达量明显减少,但可持续表达３个月之久。治疗组术后２、７、１４、２８、６０及９０天每条颈动脉均可见蓝染,其中术后７及１４天每条颈动脉横切面的全周均有蓝染,血管壁内层、中层的大部分细胞被染成蓝色。对照组所有动脉均未见蓝染。结论腺病毒载体能高效转染大鼠在体颈动脉。转染后,外源性基因的高水平表达只能维持１个月左右。     

双基因导入人脐血CD34^＋细胞共表达的调控

目的 观察携带双基因的逆转录病毒载体转导人脐血ＣＤ３４＾＋细胞后,猴病毒４０（ＳＶ４０）早启动子和内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）对载体上,下游双基因共表达的影响。方法 分别构建含ＳＶ４０早启动子和ＩＲＥＳ的双基因逆转录病毒载体ｐＬＥＳＮ和ｐＬＥＩＮ,两者均携带增强型绿色荧光蛋白和新霉素抗性ｎｅｏ基因。重组载体经包装以其病毒上清感染经磁性细胞分离仪富集的人脐血ＣＤ３４＾＋细胞,而后进行集落形成细胞测     

肌肉介导心钠素基因转移对肾性高血压大鼠的作用

目的：观察肌肉介导心钠素（ａｔｒｉａｌｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｆａｃｔｏｒ,ＡＮＦ）基因转移对肾性高血压大鼠的治疗作用。方法：利用基因克隆技术克隆和构建了高表达效率的人ＡＮＦｃＤＮＡ基因真核表达质粒,应用肌肉缝线法将质粒转移到大鼠骨骼肌中。结果：ＡＮＦ基因可以在骨骼肌中表达,并可释放入血,明显降低肾性高血压大鼠的血压,并产生利钠利尿效应,其作用可维持４～６周。结论：应用基因缝线进行肌肉介导的基因转移,可在肌肉内有效表达效应蛋白质,且可释放入血,产生药物治疗效果。     

血管形成素1基因对兔缺血心肌中血管的新生作用

目的 探讨血管形成素1基因重组腺病毒载体构建及其促进心肌缺血区血管生长的作用。方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人脾组织获取血管形成素1(Ang-1)全长cDNA,经SalI酶切并克隆到E1、E3缺失的Ad5腺病毒载体(PAxCAwt)中。应用Cosmid-TPC磷酸钙共沉淀法共转染293细胞,制备了纯化的Ang-1重组腺病毒颗粒。将获得的Ang-1重组腺病毒直接注射转染36只新西兰白兔的冠状动脉结扎后缺血的心肌内,应用RT-PCR方法测定其在转染心肌中的表达,并用免疫组织化学及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况。结果实验所克隆的Ang-1cDNA片段为含有信号肽结构的长度为1515bp的全长cDNA,与文献报道一致。Ang-1重组腺病毒直接注射转染兔缺血心肌后能有效表达,28d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组。结论腺病毒介导的血管形成素-1基因能有效地促进兔心肌缺血区血管新生及侧支循环形成。     

慢病毒载体介导hHGF基因在大鼠真皮间充质干细胞的表达

目的探讨慢病毒载体（LVs）介导人肝细胞生长因子（hHGF）基因在大鼠真皮间充质干细胞（rdMSCs）的表达,以及hHGF基因修饰对rdMSCs增殖的影响。方法体外分离培养rdMSCs,hHGF—GFP—LV以不同感染复数（MOI）转染rdMSCs,荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例;ELISA法测定感染后细胞上清hHGF水平;采用台盼蓝拒染法对hHGF基因修饰rdMSCs和rdMSCs进行细胞计数,绘制细胞生长曲线分析细胞的活力。结果rdMSCs是贴壁细胞,表达CD44和CD90,不表达CD34和CD45表面分子,可向脂肪细胞分化;MOI为100时,rdMScs能达到80％以上的感染效率;hHGF基因修饰rdMSCs细胞上清的hHGF水平高于阴性对照组（P〈0．05）。P4、P6和P8细胞的培养上清hHGF水平的差异无统计学意义（P〉0．05）;hHGF基因修饰rdMSCs有较强的增殖能力。其细胞生长曲线与rdMSCs相似。结论LVs可以介导hHGF基因在rdMSCs稳定表达,且不影响细胞的增殖活力。     

骨关节炎基因治疗现状与前景

骨关节炎的特征为持续性的关节炎症及关节损害.用传统的外科手段和给药方式很难将其治愈,因而骨关节炎基因治疗的研究已成为全世界关注的热点.北京大学第三医院运动医学研究所正在进行相关研究,将编码某一抗炎物质的基因转移到关节中,并在其中高效、长期、稳定地表达这一抗炎物质来治疗骨关节炎,将有可能改变目前治疗骨关节炎的现状.