家蚕丝素重链启动子克隆片段在家蚕体内和昆虫培养细胞内的渗漏表达

为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。     

用保幼激素和蜕皮激素处理离体培养家蚕丝腺对丝蛋白基因表达的影响

蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)具有共同调控家蚕丝蛋白合成的作用。将家蚕5龄第3天幼虫的中部和后部丝腺置于含不同浓度20E或JH的培养基中进行离体培养,于培养不同时间通过定量PCR检测丝素蛋白基因及丝胶蛋白基因的表达变化。结果表明,蜕皮激素处理对丝蛋白基因表达的影响,因激素使用剂量和作用时间不同而异;保幼激素处理会抑制丝蛋白基因的表达,尤其对丝素蛋白重链基因Bmfib-H的表达抑制作用更为明显,50 ng/m L JH处理48 h后Bmfib-H的表达水平下调1倍左右;蜕皮激素和保幼激素共同处理比单一激素处理更有助于丝蛋白基因的表达,但用保幼激素先处理丝腺24 h后再用蜕皮激素和保幼激素共同处理,会显著抑制丝素蛋白轻链基因Bmfib-L的表达。试验在排除蚕体内源激素干扰的条件下,从转录水平初步分析了保幼激素和蜕皮激素对家蚕丝蛋白基因表达的调控机制。     

家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。     

重要外文学术期刊发表蚕学论文简介

东华大学牛欠欠等利用氢氧化钠/尿素溶液,在-12℃低温下对脱胶蚕丝进行处理,逐级剥离出平均厚度0.4nm左右的纳米丝素。在这种温和处理条件下,溶剂不能完全破坏蚕丝纤维的纳米结构,但不同条件会影响纳米蚕丝的大小。分子动力学模拟表明,使蚕丝蛋白分子链间氢键断裂所需的平均作用力比断裂β-片层间的范德华相互作用力大40%,因此可以对蚕丝进行剥落处理。获得的新型纳米蚕丝含有1个β-片层和无定型的丝素蛋白分子,这可看作丝素的基本结构层次。这种单一β片层超薄新型纳米蚕丝的获得为制备更坚韧的丝基材料或提高各种应用材料的功能性和耐久性提供了有效方法。基于新型纳米蚕丝的层次结构模型,可以更深入研究丝基材料结构与性能之间的关系。     

家蚕丝素重链基因（fib-H）部分序列克隆及结构分析

通过PCR分别克隆了1个包含家蚕丝素重链基因启动子及旁侧序列（1380bp）、丝素重链基因第1内含子和第2外显子的部分序列（956bp）的2个片段,并进行了序列测定和分析,结果显示：该2个片段与已公开的家蚕丝素重链基因（GenBank登录号：AF226688）对应区域的同源性分别达98．48％和99．58％;2级结构分析显示,在启动子区域存在大量简单的反向互补序列,可形成多个潜在的茎环结构,推测这些茎环结构可能与调控蛋白的识别和作用有关;将第2外显子对应的部分氨基酸序列与其他昆虫的丝蛋白进行比对分析,发现不同的丝蛋白在比对的区域具有潜在的守恒基序,其差异序列可能与丝蛋白的特性相关。     

家蚕丝素基因的研究进展

家蚕丝素蛋白基因不仅高度专一地在后部丝腺中表达，而且在家蚕胚胎发育及幼虫发育过程中，丝素蛋白基因的表达在时间和空间上受到精细的调控，因此研究丝素蛋白基因的调控方式，能使我们了解生物体如何利用遗传信息，对基因进行时间和空间上的表达调控。调控丝素蛋白基因表达专一性的启动子／增强子结构相对较为简单，也更利于研究。本文就近年来在家蚕丝索蛋白基因研究中取得的成果进行综述。     

利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产重组蛋白的应用前景

家蚕丝腺拥有较强合成丝蛋白的能力,通过利用这一能力,使其能够大量生产有价值的蛋白,人们开始引入转基因家蚕,使它能够在丝腺中合成重组蛋白并分泌到蚕茧中。获得的重组蛋白可在生物学、生物技术,和药学领域中得到广泛应用。我们通过控制合成蛋白在丝腺中的定位,在后部丝腺(PSG)中表达重组蛋白使其定位在不能溶解的丝素中,在中部丝腺(MSG)中表达则定位于亲水外层的丝胶层中。本文主要讨论将转基因家蚕丝腺生物反应器作为优良工具,应用于大量生产药用蛋白和在工业化水平生产相关重组蛋白的可能性,以及生产重组蛋白过程中所面临的挑战和未来的应用前景。     

蚕丝蛋白制备方法的研究

以废蚕茧丝为原料,将脱胶丝素通过盐解、酶解、碱解等方法,制备了溶液状、粉末状丝素蛋白。以沸水提取丝胶蛋白,采用二次水解、碱解等方法,制备了溶液状、粉末状丝胶蛋白。采用SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳和红外光谱等检测分析了蚕丝蛋白的结构特征,探讨了制备方法对蚕丝蛋白结构和产率的影响。结果表明,不同方法制备的丝素蛋白、丝胶蛋白具有不同的分子量分布和不同的产率,其分子结构以无规卷曲为主。     

家蚕丝素重链非重复区肽段在大肠埃希菌中的优化表达

丝素重链是家蚕丝素蛋白的主要组成部分,位于丝素重链中间的核心区域由12个重复区肽段和11个非重复区肽段组成,非重复区是含有大量极性侧基的亲水性肽段。为了研究丝素重链各重复区组成序列的结构及其在生物医学领域的适用范围,需要对其进行高纯度分离。克隆了丝素重链非重复区编码基因片段f(1)及其延伸片段f(4)和f(8),并构建重组质粒在大肠埃希菌(Escherichia coli)中诱导表达融合蛋白GST-F(1)、GST-F(4)和GST-F(8)。通过三点设计法优化诱导剂IPTG浓度、起始菌密度和诱导时间,采用SDS-PAGE电泳和BCA蛋白浓度检测法定性、定量分析融合蛋白的表达水平,确定了融合蛋白GST-F(1)、GST-F(4)和GST-F(8)的最佳诱导表达条件:起始菌密度D(600 nm)值分别为1.5、1.2和0.9,诱导剂浓度分别为0.2 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3 mmol/L,诱导时间分别为3 h、4 h和5 h。在上述最佳诱导表达条件下,3种融合蛋白的表达量达到50~90 mg/L,可满足后续研究的需求。     

家蚕5龄幼虫期乙酰化修饰丝胶蛋白对蚕丝性能的影响

乙酰化修饰即在翻译中或翻译后的蛋白质分子链上嫁接乙酰基团,是通过化学修饰改变蛋白质性质的方式之一,丝胶蛋白是高度乙酰化的蛋白质。以丝腺组织大量合成丝蛋白的家蚕5龄第2天幼虫供试,分别将去乙酰化酶抑制剂TSA和乙酰化酶抑制剂C646自幼虫第2腹节注射入体内丝腺,上调和下调丝胶蛋白的乙酰化水平,探究通过乙酰化修饰丝胶蛋白的方法改善蚕丝性能的可行性。收集试验组家蚕的茧丝进行力学性能测试、红外光谱分析、X射线衍射分析、扫描电子显微镜(SEM)观察,结果证实丝胶蛋白的乙酰化修饰并不会改变蚕丝丝素的晶体结构,但具有增强丝胶与丝素表层附着力的作用。研究结果可为蚕丝精练脱胶和染整工艺的改进提供新的理论依据。     

不同截短的丝素重链基因启动子驱动报告基因在家蚕组织中的表达

应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,研究不同截短的丝素重链基因启动子(-2127/+23、-925/+23和-238/+23)驱动报告基因在家蚕5龄幼虫组织中的表达情况。结果发现,通过病毒感染介导,3种长度丝素重链基因启动子驱动的报告基因在脂肪体和血细胞中存在异位表达,从个体体表可直接观察到明显的绿色荧光;3种长度的启动子都能在后部丝腺中高效起始EGFP的转录,产生绿色荧光;长度为0.9kb和0.2kb的启动子0.9KH、0.2KH在中部丝腺能起始EGFP转录产生绿色荧光,而2.1kb的启动子(2.1KH)能起始EGFP转录,但未能检测到绿色荧光;3种长度的启动子也能在Sf9培养细胞中起始EGFP基因表达。上述结果表明,丝素重链基因启动子没有严格的组织特异性。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

促细胞生长再生复合丝素蛋白电纺丝非织布的性能

利用家蚕丝素蛋白独特的力学和生物学特性,以电纺蚕丝纤维为载体,通过加入含有细胞粘附构型肽段(TGRGDSPAS)8的纯化细胞粘连性蛋白,改善丝素蛋白在促细胞生长方面的生物学功能。红外光谱检测表明,加入10%的细胞粘连性蛋白并不会明显影响丝素蛋白电纺丝的α-螺旋和β-构象,细胞培养试验中也表现出促进细胞增殖的作用,其活性细胞数目较单纯丝素蛋白纤维上的活性细胞增加,约为1.5×104cm-2,并对细胞形态没有影响。电镜扫描显示,以加入10%细胞粘连性蛋白后的电纺蚕丝纤维直径仍呈均匀分布状态。依据研究结果认为,以加入细胞粘连性蛋白的再生复合丝素蛋白电纺丝非织布纤维作为生物医学材料,具有更加良好的应用前景。     

丝素蛋白吸附金属离子的性能及其机理的研究

丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分,具有较好的吸湿性、透气性、吸附性等。而现今人类生活环境中存在较多的有害金属离子,因此拓展丝素蛋白吸附金属离子的用途具有重要的意义。本文在前期研究已证实丝素蛋白具有较好的吸附重金属离子能力的基础上,进一步测定分析了不同状态下的丝素蛋白（溶液状、凝胶状、粉末状）对金属离子（以锌为例）的吸附作用,探讨了丝素蛋白二级结构的变化,阐明了丝素蛋白吸附金属离子的机理。结果显示：丝素蛋白吸附锌离子时,氢元素与氧元素参与了其反应,而氮元素也可能参与了反应,丝素蛋白肽链上的-OH、-CO-NH-以及-NH2与Zn2+通过配位键形成了配合物;且丝素蛋白β-折叠增加而无规卷曲减少,丝素蛋白与Zn2+形成的配合物具有更稳定配位结构;同时pH对该配位反应过程也存在一定的影响。     

采用吡啶三氧化硫制备硫酸化丝素及其抗凝血性能检测

硫酸化丝素是一种新型的蛋白基抗凝血医用材料。以丝素蛋白和吡啶三氧化硫为原料制备可溶性硫酸化丝素。对硫酸化处理不同时间获得的丝素蛋白样品进行红外光谱检测,结果表明用吡啶三氧化硫处理可溶性丝素蛋白2h以上可以将SO42-接枝到丝素蛋白上,当处理时间达到6h后含硫量达到最大值(1.26mmol/g)。将此硫酸化丝素配制成质量浓度为0.8mg/mL的溶液,其抗凝血效果能达到0.06mg/mL肝素钠的抗凝血水平,使血液在1h内不会凝固。该制备方法简单易行,得到的硫酸化丝素的抗凝血效果良好,有望进一步开发成为新型医用抗凝血材料。     

丝素、丝胶质量标准指标的研究

为进一步制订丝素和丝胶的质量标准,并用以指导蚕丝蛋白规范生产,检测分析了丝素与丝胶中的氨基酸含量、干燥失重和灰分等质量指标,砷、铅等重金属含量的安全性指标,以及菌落总数、大肠菌群和致病菌等微生物指标。参照食品、化妆品等国家标准限量规定,结合蚕丝蛋白的特性和生产制备现状,初步提出了评价丝素与丝胶质量优劣的指标及相应的数值范围。     

柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5'端片段的克隆与表达分析

柳蚕(Actias selene Hübner)是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫.利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5'端的一个片段,该片段序列长819 bp, 编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域.序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕(Saturnia japonica)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)和家蚕(Bombyx mori) 的Fib-H基因cDNA 5'端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%.半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5'端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势.     

丝素蛋白/戊二醛对脆弱丝绸织物加固的工艺条件研究

采用丝素蛋白和交联剂戊二醛作为加固脆弱丝绸织物的材料,通过正交试验,研究了丝素蛋白和戊二醛的质量浓度、浸渍时间等因素对脆弱丝绸织物断裂强度、断裂伸长率、增重率、回潮率、色差、硬挺度等的影响,得出较优的加固处理工艺方案:丝素蛋白质量浓度为5 g/L,戊二醛质量浓度为0.05 g/L,在丝素蛋白溶液中的浸渍时间(t1)为40 min,戊二醛中的浸渍时间(t2)为60 min。在此工艺条件下,丝素蛋白/戊二醛对脆弱丝绸织物的加固效果明显,而且手感和外观较好。可利用该方法及工艺对丝绸文物进行加固保护。     

柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5′端片段的克隆与表达分析

柳蚕(Actias selene Hübner)是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫。利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5′端的一个片段,该片段序列长819 bp,编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域。序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕(Saturnia japonica)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、印度柞蚕(Antheraea mylit-ta)和家蚕(Bombyxmori)的Fib-H基因cDNA 5′端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%。半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5′端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势。