茶硝香酰胺联合吉非替尼对人非小细胞肺癌迁移的影响

本实验旨在探究茶氨酸衍生物茶硝香酰胺(TNC)和吉非替尼联合是否增强吉非替尼对人非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响与其可能作用的分子机制,为抑制肺癌远处转移和减少吉非替尼毒副作用提供新思路.采用细胞划痕术检测联合用药前后细胞迁移能力变化;上皮-间质转化(EMT)诱导实验结合Transwell实验观察发生EMT后A549迁移能力改变;蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达.结果显示:TNC联合吉非替尼可显著抑制A549细胞迁移,且间质标志物N-Cadherin、Vimentin显著下调,上皮细胞标志物E-Cadherin明显上调,与迁移相关转录抑制因子ZEB、Slug、Snail、Twist表达显著下降,同时AKT、NF-κB等蛋白表达水平下调.提示TNC联合吉非替尼可能是通过抑制A549细胞的EMT过程从而增强吉非替尼对A549细胞迁移的抑制作用.     

线粒体lncRNA IDL影响非小细胞肺癌氧化磷酸化

为了探究线粒体长链非编码RNA(mitochondrial long non-coding RNA,mtlncRNA)IDL在人非小细胞肺癌细胞(human non-small cell lung cancer, NSCLC)代谢和生长中的作用及机制，本研究首先在A549细胞中通过线粒体压力测试发现敲低IDL会导致细胞的氧化磷酸化功能受损，接着通过细胞增殖实验、划痕实验和克隆形成实验，证明了敲低IDL时人非小细胞肺癌细胞A549和H1299的生长速度变慢、迁移能力和克隆形成能力减弱.随后通过RNA沉降实验(RNA pull-down)和RNA免疫沉淀实验(RIP)找到了在体内外均可以与IDL特异性结合的蛋白——ATP合成酶α亚基，即ATP5A1蛋白，并通过免疫共沉淀实验(Co-IP)证明了IDL下调会导致ATP5A1蛋白的O-GlcNAc修饰水平增加，在A549细胞中敲低ATP5A1也得到了与敲低IDL时一致的细胞表型.以上结果说明敲低IDL会导致非小细胞肺癌细胞氧化磷酸化功能受损、细胞生长受抑制.     

真核延伸因子-1A2基因在宫颈癌侵袭和迁移中的作用研究

目的探讨真核延伸因子-1A2(eEF1A2)基因对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法设计eEF1A2基因的siRNA干扰片段分别转染宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞和C33A细胞,实验组包括:转染Si-eEF1A2-1和SieEF1A2-2的细胞组,未转染的细胞和非干扰转染细胞(NC组)为对照组。采用Western blot方法检测eEF1A2和E-cadherin在宫颈癌细胞中蛋白质表达水平,通过划痕实验和基质胶包被transwell实验分析细胞迁移能力,通过CCK-8实验和平板克隆实验检测细胞增殖。结果宫颈癌细胞中,siRNA干扰的细胞与对照组相比eEF1A2蛋白质表达水平降低,E-cadherin蛋白质表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);划痕实验si-eEF1A2转染的细胞与对照组相比较,愈合间隙宽,差异有统计学意义(P0.05); Transwell迁移实验,RNA干扰的细胞与对照组相比,穿过小室基底膜的细胞明显少于对照组,差异有统计学意义(P0.05); si-eEF1A2干扰的细胞CCK8增殖实验、细胞克隆形成实验中可以抑制宫颈癌细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。结论降低宫颈癌SiHa、HeLa和C33A细胞eEF1A2基因表达水平,可以抑制癌细胞的侵袭和迁移。     

GRP78异常O-糖基化对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响

为了探索O-糖基化异常对GRP78促进人乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移能力的影响,克隆人GRP78基因,利用点突变技术,构建了GRP78野生型及T648A、T648G2个糖基化位点突变真核表达载体.Western blot检测外源性GRP78在MCF-7细胞中的表达.利用划痕修复实验和transwell侵袭小室实验,研究GRP78第648位Thr突变后引起的异常糖基化对其生物学功能的影响.划痕实验结果显示与野生型相比,转染突变体的MCF-7细胞的覆盖面积较少.Transwell检测结果显示突变体转染组的侵袭细胞数少于对照组,说明GRP78 O-糖基化缺失后明显降低了其促进MCF-7细胞侵袭迁移的能力.本研究为深入探讨O-糖基化在介导GRP78生物学功能中的作用机制奠定了基础.     

Transwell法检测细胞侵袭迁移能力实验中的影响因素

对常用于检测细胞侵袭迁移能力的Transwell检测方法进行分析总结,旨在提高Transwell方法检测细胞侵袭迁移能力的一致性与稳定性。以肺癌细胞为例,对Transwell检测细胞侵袭能力中常遇到的部分细节问题进行分析,对实验中的影响因素提出应对策略,给予相应解决方案。实验发现,在Tranwell实验中,细胞种类、Transwell孔径、基质胶浓度、细胞接种数量、染色等细节问题均为该实验的关键点;并根据分析得到细胞侵袭及迁移实验中关键的影响因素,提出应对方案,可以有效提高实验结果重复性及稳定性。     

SCP1对人乳腺癌细胞迁移和增殖的影响及其机制

SCP1是一种膜定位的磷酸酶,可以去磷酸化RNA聚合酶Ⅱ并沉默神经元基因.目的:探讨SCP1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和增殖能力的影响,并研究其机制.方法:荧光定量PCR法检测多种癌细胞中SCP1的表达;体外划痕实验检测SCP1对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响;Transwell TM细胞侵袭实验检测SCP1对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;MTT法检测SCP1对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响;Western blot法检测SCP1对细胞信号通路分子p-AKT表达的影响.结果:SCP1多种癌细胞中均有表达;SCP1能抑制MDA-MB-231细胞的迁移及增殖能力;抑制SCP1的表达能显著上调MDA-MB-231细胞p-AKT的表达.结论:SCP1可能通过去磷酸化AKT抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭.     

SLC44A5对肺腺癌细胞迁移影响

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤.SLC44A5是一种胆碱转运蛋白,其与肿瘤关系的相关报道较少.有报道显示其与肝癌的发生发展有关,然而其在肺癌中的作用尚未有相关报道.为探讨SLC44A5的影响,使用人肺腺癌细胞系H1299和H1792构建SLC44A5低表达细胞系,利用MTT法证明敲低SLC44A5会抑制细胞增殖.使用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验证明敲低SLC44A5抑制细胞迁移.结果表明SLC44A5可能参与了肺癌的转移,具有成为肿瘤治疗分子靶点的潜力.     

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对恶性神经胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响。采用HCMV(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,Transwell体外迁移实验、Transwell体外侵袭实验检测HCMV感染对U87细胞迁移侵袭能力的影响;Western-blot检测肿瘤迁移、侵袭的标志性蛋白局部粘着斑激酶(FAK)及pTyr397FAK的表达变化。Transwell结果显示,HCMV感染U87细胞后迁移侵袭到小室膜下的细胞数量明显高于未感染组(P0.05);Western-blot结果显示,HCMV感染组及对照组均出现FAK、pTyr397FAK蛋白的表达;HCMV感染组pTyr397FAK蛋白相对表达量高于对照组(P0.05)。HCMV感染U87细胞通过促进FAK,Tyr397的磷酸化而促进胶质瘤U87细胞的迁移及侵袭。因此,抑制HCMV感染细胞后的FAK蛋白的磷酸化可以成为恶性胶质瘤预防及治疗的新靶点。     

过表达BMP7对HL-7702细胞功能的影响

目的建立HL-7702细胞BMP7基因转染细胞系,并检测其增殖和迁移能力的变化。方法脂质体介导方法转染细胞,采用RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达以评价其转染效果;用MTT、划痕实验检测转染后增殖及迁移能力的变化。结果成功建立转染细胞系,转染BMP7基因后HL-7702细胞增殖和迁移能力有所增强。结论 BMP7基因高表达可能是肝细胞癌变的原因之一。     

扁塑藤素对非小细胞肺癌增殖及线粒体膜电位的调节作用

目的 分析扁塑藤素对体内外非小细胞肺癌增殖及线粒体膜电位的调节作用,初步探讨扁塑藤素的抑瘤增殖效果及可能机制.方法 将适量的扁塑藤素提取物分别作用于非小细胞肺癌细胞系(A549及H226)及动物模型(BALB/c裸鼠),应用MTT方法测定其细胞存活率,应用细胞集落实验检测其长期毒性作用.制备A549非小细胞肺癌裸鼠模型,测定PTM对移植瘤体积及湿重的生长抑制.应用流式细胞术测定PTM共培养后细胞线粒体膜电位.结果 与空白对照组比较,A549和H226两组细胞随PTM剂量的增加及共培养时间的延长细胞的平均存活率显著降低.与对照组(PTM:0μmol/L)比较,0.1μmol/L组A549及H226的细胞集落形成均受到抑制,并且0.2μmol/L组的细胞集落形成抑制更为明显.PTM腹腔内注射治疗第7天,PTM 2 mg/kg治疗组的移植瘤(A549)体积抑制作用优于PTM 1 mg/kg治疗组(P<0.05).湿重对比分析结果显示:PTM 2mg/kg治疗组移植瘤湿重低于空白组及PTM 1 mg/kg治疗组(P<0.05).流式细胞术测定结果显示:PTM(8μmol/L)对各组细胞(A549和H226)作用时间持续3 h即可导致细胞线粒体膜电位下降,持续6 h时线粒体膜电位下降更为明显,提示PTM作用时长与细胞(A549和H226)线粒体膜电位呈负性相关.结论 PTM对体内外非小细胞肺癌(A549和H226)的细胞抑制作用存在剂量和时间依赖性,并初步证明PTM具有诱导细胞线粒体去极化的作用.     

Eaf2在胃癌中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

为了揭示Eaf2对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭和迁移的影响,使用定量Real-time PCR分析了50例胃癌组织(C)及其癌旁(N)中Eaf2的表达。用pcDNA3.1载体构建过表达Eaf2质粒(pcDNA-Eaf2),以空载体pcDNA3.1(pcDNA-NC)作为对照,利用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室和划痕实验检测细胞侵袭能力和迁移能力。Real-time PCR结果显示42例(84%)胃癌组织Eaf2表达下调,提示Eaf2作为抑癌基因起作用。过表达Eaf2能显著抑制MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P0.05)。结果提示Eaf2表达下调可能与胃癌的发展进程有关。     

LncRNA SIL沉默促进A549细胞增殖和迁移

研究了lncRNA SIL与肺纤维化中肺泡上皮细胞的增殖和迁移之间的关系.设计小干扰RNA沉默内源性lncRNA SIL的表达,通过RT-PCR、MTT、Western blot、细胞损伤修复实验及Transwell实验研究沉默后细胞的增殖和迁移变化.MTT结果显示:沉默lncRNA SIL后细胞的增殖能力与对照组相比...     

钾通道阻断剂对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响

为了检测电压门控钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)、四乙胺(TEA)和ATP敏感钾通道阻断剂格列苯脲(Glibenclamide,Gli)对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响,选用人胶质瘤细胞系U87和U251,其中钾通道阻断剂4-AP、TEA及Gli处理作为实验组,未处理的作为对照组.采用划痕实验和Transwell小室法检测钾通道阻断剂对U87和U251细胞迁移和侵袭能力的影响; Western blot检测药物处理后细胞高迁移率蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表达水平.结果表明:5 mmol·L^-1的4-AP、40 mmol·L^-1的TEA及400 μmol·L^-1的Gli可以显著抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭,并降低HMGB1表达水平.电压门控钾通道和ATP敏感钾通道对胶质瘤细胞迁移和侵袭具有重要调控作用,3种钾通道阻断剂对胶质瘤细胞迁移和侵袭有不同程度的抑制作用,可能通过调控HMGB1相关通路实现.     

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞药物泵P-gp及LRP蛋白表达的影响

目的:用补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,观测药物泵P-gp及LRP的表达,并同小干扰RNA片段(siRNA)靶向切除P-gp、LRP基因后对这两种蛋白表达的影响相比较.方法:补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,设计并合成针对P-gp、LRP基因对应序列的siRNA,采用转染试剂对细胞进行转染.两种蛋白实验分组均为:空白对照组、含药血清处理组及siRNA处理组.采用RT-PCR检测P-gp及LRP mRNA,免疫细胞化学法检测蛋白表达及定位,WB检测蛋白表达.结果:补中益气汤含药血清可以降低两种药物泵的表达,效果同siRNA类似,具有统计学差异(P0.05).结论:补中益气汤含药血清能降低A549/DDP细胞上P-gp和LRP的表达.     

低表达长非编码RNA MALAT1对人宫颈癌HeLa细胞体外生长和迁移的影响

设计3个针对MALAT1不同靶序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 筛选出有效的siRNA序列, 设计并构建短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰质粒, 转染到HeLa细胞中, 构建低表达MALAT1的稳定细胞株.通过细胞的生长曲线和细胞划痕实验验证降低MALAT1对HeLa细胞增殖和迁移的影响.结果显示MALAT1表达水平在HeLa细胞中得到有效地降低, 低表达MALAT1的HeLa细胞生长速度和迁移速度减小.表明MALAT1在HeLa细胞中具有调控细胞增殖和迁移的能力     

环状RNA hsa_circ_0055176对口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨环状RNA hsa_circ_0055176对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞迁移和侵袭能力的影响.方法:35例口腔鳞状细胞癌患者,用实时荧光PCR检测hsa_circ_0055176在OSCC及相应癌旁组织和OSCC细胞系中表达水平.用慢病毒感染或SiRNA转染SCC25和CAL27细胞,检测环状RNA对OSCC细胞生物学行为的影响.结果:环状RNA hsa_circ_0055176在OSCC组织表达低于癌旁组织(t=4.52,P0.001);在OSCC细胞系表达低于人类角质形成细胞(t_(CAL27)=18.58,t_(SCC9)=12.21,t_(SCC15)=10.11,t_(SCC25)=16.88,P0.001).临床数据分析表明与颈淋巴结转移相关(t=12.28,P0.05).SCC25和CAL27细胞中hsa_circ_0055176表达上调或下调均影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力.结论:环状RNA hsa_circ_0055176在口腔鳞癌低表达可增强口腔鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭能力.     

非小细胞肺癌细胞A549对紫杉醇耐药机理研究

目的利用非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol,研究其对紫杉醇耐药性的分子机理.方法通过长时间低浓度的紫杉醇处理A549细胞的方法获得其耐药细胞株A549/taxol,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR观察其凋亡基因的表达情况,并通过不同siRNA处理细胞进行基因沉默,研究其在不同遗传背景下对紫杉醇的耐受情况.结果发现非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol的基因表达紊乱,表现为ING5的高表达抑制了凋亡基因Bcl-2的表达水平,而Bcl-2是紫杉醇诱导细胞凋亡所必需的.结论以上结果初探了A549对紫杉醇耐药性的机制,为探寻紫杉醇化疗新策略提供了新的思路.     

PPM1A抑制胰腺癌细胞PANC-1的迁移侵袭和EMT进程

为研究镁依赖性蛋白磷酸酶1A(protein phosphatase magnesium-dependent 1A,PPM1A)对胰腺癌细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)的影响,采用生物信息学技术以及细胞免疫荧光实验分析PPM1A在胰腺癌中的表达情况,划痕、Transwell、qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光实验检测PPM1A对胰腺癌细胞PANC-1迁移、侵袭及EMT标志物表达水平的影响,生物信息学网站预测PPM1A的上游miRNA.结果表明,PPM1A在胰腺癌中低表达,抑制PANC-1细胞的迁移、侵袭和EMT进程,miR-105-5p为PPM1A的潜在上游miRNA.说明PPM1A和miR-105-5p可能是治疗胰腺癌新的靶点.     

miR-193b通过负向调控MCT7基因的表达抑制人胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭

为探讨miR-193b对人胶质瘤U251细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用HiPerFect转染试剂瞬时转染miR-193b模拟物(mimics)上调U251细胞中miR-193b的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率,然后进行细胞划痕实验及侵袭实验,分别检测miR-193b对U251细胞迁移及侵袭能力的影响.结果显示过表达miR-193b可抑制U251细胞迁移和侵袭的能力.应用生物信息学软件预测,提示单羧酸转运蛋白7(MCT7)基因可能是miR-193b的潜在靶基因.进而构建双荧光素酶报告基因系统从转录水平上证明MCT7为miR-193b调控的靶基因;qRT-PCR及蛋白质免疫印记(Western blot)分别在mRNA和蛋白水平上进一步证明MCT7基因的表达受miR-193b的负调控.由此可见,miR-193b很可能通过负向调控MCT7基因的表达来抑制U251细胞的迁移与侵袭.     

X连锁凋亡抑制蛋白对肺癌细胞生长和细胞周期的影响

为了研究靶向X连锁凋亡抑制蛋白的发夹状RNA对肺癌细胞中抗肿瘤作用,构建XIAP基因的shRNA表达载体,并设计阴性对照(psiRNA-Con)质粒,分别转染A549细胞;实时定量PCR和免疫印记法分别检测XIAP的mR-NA和蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐试验(MTT)检测A549细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期分布。实验结果表明:转染psiRNA-XIAP组细胞XIAP mRNA和蛋白水平均低于正常对照组,生长慢于正常组(t=16.82和t=12.13,均P<0.01),G2/M期细胞所占比例增高(t=3.78,P<0.05),并出现亚G1峰。而阴性对照质粒psiRNA-Con未能下调XIAP的表达水平,对A549细胞增殖和细胞周期亦无明显影响。结论:针对XIAP的RNA干扰质粒特异性地抑制了其RNA和蛋白水平,使肺癌细胞A549生长减慢,诱导凋亡,并使其发生G2/M期阻滞,有望发展为新的抗肿瘤药物。