浒苔(Ulva prolifera)共附生细菌群落结构分析的引物优化

海藻共附生细菌密切参与宿主的生长发育、营养吸收等重要过程,浒苔(Ulva prolifera)是构成黄海绿潮的唯一优势种,对其共附生细菌开展群落结构分析,有望为成灾机制研究提供重要线索。由于植物叶绿体基因组同时具备原核特征和高拷贝数,会严重干扰共附生细菌基于16S rDNA的序列扩增。高等植物中开发了通用引物799F,利用其3′末端与植物同源区的非配对双碱基,可实现对细菌来源序列的特异性扩增。本文针对多个浒苔群体样本,首次评价了引物799F在藻类中的适用性,发现799F的3′末端与浒苔叶绿体同源区仅存在非配对单碱基,其扩增仍会受到浒苔叶绿体严重干扰。在引物799F的基础上,设计了新引物800F,与通用反向引物1492R配对扩增细菌16S rDNA中具高分辨率的V5-V9可变区,配合使用具热启动功能、同时不具校对功能的DNA聚合酶,可基本完全避免浒苔叶绿体来源序列的扩增,并阐明了方法的原理。优化的引物扩增方案可用于浒苔共附生细菌群落结构分析。     

氮磷营养盐对浒苔生长影响的初步探讨

在实验室条件下,设置不同的N、P浓度,研究单因子(P:30μmol/L,N:0～500μmol/L和N:500μmol/L,P:0～30μmol/L)对浒苔(Enteromorpha prolifera)生长的影响。结果表明:在高N、P浓度(N:500μmol/L,P:30μmol/L)条件下浒苔生长态势最好,具有较高的相对生长率(0.451)。添加N可以明显促进浒苔的生长,而且随着添加N浓度的提高促进作用增强,浒苔的相对生长率有较大幅度提高。添加P对浒苔的生长也具有一定的促进作用,但促进作用不如添加N的明显;随着添加P浓度的提高,浒苔的相对生长率提高幅度不大,这说明浒苔生长对N变化更为敏感。     

绿潮藻浒苔微生物高效降解及生物乙醇制备

从绿潮藻暴发海域的底泥和腐烂浒苔(Ulva prolifera)中,筛选出一株可高效降解浒苔纤维素的微生物菌株(F菌株),通过刚果红染色实验以及真菌的ITS分析,鉴定为曲霉属真菌。以浒苔为诱导培养基制备F菌株的粗酶液,测得其滤纸纤维素酶活为34.79 U/m L。在发酵实验中,当酶解条件为6%的粗酶液添加量、反应温度为38℃、反应时间为60 h、pH为6.8时,浒苔纤维素降解效果最好,酶解液发酵乙醇产量最高达到28.98 g/L。     

浒苔(Ulva prolifera)漂浮生态型的分枝表型及其可塑性

黄海绿潮由浒苔漂浮生态型主导,普遍认为其具有高度分枝的表型特征,但始终缺乏形态学的量化表征。本研究针对浒苔的分枝表型,通过广泛采集漂浮生态型与定生群体样本,使用最高分枝级数和一级分枝密集度两个形态学指标进行了量化表征,结果表明,定生浒苔普遍仅有一级分枝或无分枝,而漂浮生态型分枝级数最高可达五级,其一级分枝密集度是定生浒苔的5.8倍,说明漂浮生态型的分枝程度显著高于定生浒苔。另外,无论自然条件还是人工培养条件下,发现漂浮生态型分枝表型的可塑性也明显强于定生群体。上述结果提示,高度分枝表型是漂浮生态型重要的漂浮适应性特征;而分枝表型的强可塑性,可能有助于其适应漂浮过程中多变的海洋环境。上述结论可为后续深入研究提供形态学量化指标和重要理论依据。     

2017年绿潮浒苔(Ulva prolifera)生理特征及孢子囊形成情况分析

近几年来在我国青岛海域连续暴发的浒苔绿潮造成了巨大的经济损失并且破坏了近海海洋生态系统平衡。因此,浒苔绿潮受到了越来越多的关注。本研究重点关注了绿潮暴发期间不同海域浒苔藻体生理特征和孢子囊形成情况。研究发现,不同海域里浒苔藻体生理特征差异显著,孢子囊比例显著不同,并且观察到漂浮浒苔的原位萌发。2017年5月中旬,我们在苏北浅滩紫菜养殖区域(33.78°N,121.29°E)对筏架绠绳上生长的绿藻,退潮后滩涂散落的绿藻和涨潮时海面上漂浮的绿藻进行为期5天的野外采集。另外,在2017年6月随科考船对浒苔暴发海域的浒苔样本进行采集。采集范围在(33.5°—36.5°N, 120°—124°E)。结果表明,从低纬度到高纬度,浒苔F_v/F_m(光系统Ⅱ最大光化学量子产量)值从0.65逐渐降低至0.3左右;YⅡ(光系统Ⅱ实时光化学量子产量)值也从最高0.5左右降低至最低0.1。此外,定生浒苔F_v/F_m值为0.6—0.8左右,明显高于漂浮浒苔; YⅡ值也有类似趋势。在孢子囊形成比例方面,定生浒苔约有5%藻体形成了孢子囊,而漂浮浒苔中孢子囊形成比例达到20%。数据表明,低纬度区域为浒苔来源地,浒苔生理活性良好,孢子囊形成比例低。随着浒苔往北漂移,其生理活性降低。并且,漂浮浒苔孢子囊形成比例显著性高于定生浒苔。本文认为,浒苔脱离来源区后,孢子囊的快速形成、成熟和孢子释放以及孢子的原位萌发是浒苔生物量激增的重要原因。     

浒苔多糖对羟自由基的清除作用研究

研究确定了Fenten(水杨酸法)反应所需水杨酸、H2O2和Fe2+的浓度,并用水杨酸法对浒苔(Entero-morpha prolifera)水提多糖及其酸提多糖对羟自由基的清除能力进行了测定,同时,与合成抗氧化剂BHT和TBHQ进行对比。结果表明,浒苔水提多糖及酸提多糖对羟自由基均有一定的清除效果,且清除率与浓度存在剂量依赖关系,酸提多糖对羟自由基的清除能力大于水提多糖。在较高质量浓度(1.2 g/L)时酸提多糖对羟自由基的清除能力是水提多糖的2倍。     

基于HJ-1A/1B的2014年黄海海域浒苔灾害时空分布

自2007年以来, 黄海海域每年的5月初～8月中下旬浒苔(Ulva prolifera)会周期性地暴发与消亡,导致海洋生态环境被破坏以及经济损失。利用2014 年的HJ-1A/1B遥感影像, 利用神经网络监督分类及RULE规则影像重分类动态阈值法, 对2014年的浒苔的漂移路径、各时期影响的海域面积、分布面积以及暴发高峰期的最大面积进行了动态监测。结果表明, 2014年浒苔持续时间为101 d, 5月中旬开始在江苏省盐城市近海出现零星斑点, 分布面积为2.299 km², 影响面积为1 744.799 km²; 6月初到6月中旬浒苔广泛分布于黄海海域, 分布面积扩大至1 367.145 km², 达到当年的峰值; 从6月下旬开始, 浒苔进入衰退期, 浒苔分布面积、相对聚集密度均急剧缩小, 但影响面积的峰值出现在该时期; 8月初消亡于青岛附近海岸, 8月20日遥感影像已难以监测到浒苔的存在。2014年黄海海域浒苔经过了“出现—发展—暴发—衰退—消亡”5个发展阶段。     

超声波辅助提取RP-HPLC法测定浒苔中的叶绿素a、b

建立了一种反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定浒苔(Enteromorpha prolifera)中叶绿素a和b含量。采用的色谱条件:Diamonsil-C18(4.6mm×150mm)柱,流动相为甲醇(含0.2%的乙酸)和丙酮,梯度洗脱,流速为0.8mL/min,进样量10μL,检测波长430nm。在此条件下,叶绿素a和叶绿素b与浒苔中的其他化合物分离良好,叶绿素a、b质量浓度为0.50～500mg/L具有良好的线性关系(R2=0.9999),能对浒苔提取液中的叶绿素a、b进行准确定量。     

浒苔原生质体再生苗对草丁膦与6种抗生素的敏感性

浒苔(Ulva prolifera)是构成黄海绿潮的优势种,通过构建浒苔稳定转化系统,可以为相关基因功能验证提供有力工具。本文以浒苔原生质体再生苗为材料,试验了对除草剂草丁膦和6种抗生素的敏感性,发现浒苔对氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸链霉素、Zeocin 4种抗生素不敏感,对氯霉素、潮霉素较敏感,对除草剂草丁膦极为敏感,进一步统计得出草丁膦对浒苔的半致死剂量(LD50)和95%可信限,发现敏感性与光周期明显相关。上述结果为进一步筛选转化子、构建浒苔稳定转化系统打下了基础。     

浒苔多糖的分级纯化及保湿活性研究

用DEAE-Sepharose FF离子交换凝胶层析柱对浒苔(Enteromorpha)多糖进行分级纯化,利用HPLC色谱分析了单糖组成,并以甘油和透明质酸为对照,研究其吸湿和保湿活性。结果表明,浒苔多糖主要为葡萄糖醛酸-鼠李糖-木糖-甘露糖聚合物;浒苔多糖主要由两种组分组成,其一组分木糖和鼠李糖含量摩尔比为1.11:1,另一组分木糖和鼠李糖含量比为1:3.28;浒苔多糖具有与透明质酸相似的吸湿和保湿能力。     

浒苔孢子在不同材料基质上的附着萌发差异性研究

本研究针对黄海绿潮早期发生过程,以浒苔生殖细胞附着生长特征为切入点,以其主要原因藻种浒苔(Ulva prolifera)为材料,对比研究了不同材料附着基质对浒苔孢子附着萌发的影响。发现孢子在2—6h内的附着率达到80%,尤其是在前2h内的附着速率最快,而且在不同材料的基质上都能完成附着萌发,但萌发数量存在显著差异性,孢子在紫菜养殖筏架相关材料(塑料、竹片、尼龙网衣、塑料网衣)上的萌发率显著高于浅滩、礁石和养殖池相关材料(细砂、海泥、石块)。浒苔孢子还可以在藻段上完成附着萌发,而橡胶和鱼粉袋相关材料对浒苔孢子的萌发存在抑制作用。对比浒苔孢子和配子的萌发特性发现两者有异同点,两者在塑料、竹片等筏架相关材料上萌发率均较高,而孢子在藻段以及橡胶浸出液和鱼粉溶液中的萌发数均显著高于配子。本研究发现紫菜养殖筏架更有利于浒苔孢子的附着萌发,这进一步说明苏北浅滩数十万亩的紫菜养殖筏架在绿潮早期形成过程中为浒苔孢子提供了重要的附着基质。本研究结果将为探讨紫菜养殖筏架在绿潮早期发生过程中的重要作用,并为养殖筏架防附着材料的选用提供参考。     

浒苔光照和盐度胁迫响应基因UpMYB44的克隆与表达分析

为证明R2R3-MYB转录因子在浒苔响应非生物胁迫例如盐度和光照的过程中发挥的重要调控作用,利用实时荧光定量PCR、酵母双杂交系统、亚细胞定位等技术,研究获得了浒苔UpMYB44基因1 437 bp的开放阅读框(ORF)全长序列,编码478个氨基酸,属于典型的R2R3-MYB转录因子并通过烟草叶片转化确定其定位于细胞核,UpMYB44参与浒苔响应光照和盐度的胁迫过程,其中在低光和高盐胁迫下UpMYB44基因的相对表达量升高。筛选出了与UpMYB44互作的UpCPP5蛋白,该蛋白与浒苔的生长和细胞分裂有关,推测UpMYB44可能通过与UpCPP5互作,形成蛋白复合体参与浒苔的增殖过程。研究为日后深入探究MYB类转录因子家族调控藻类生长发育的过程奠定了基础,同时为研究浒苔快速繁殖的机制提供了思路。     

盐度对浒苔(Ulva prolifera)微观繁殖体萌发生长及藻体繁殖的影响

黄海绿潮起源于苏北浅滩,每年夏天漂移到青岛沿岸泛滥成灾,对生态环境造成严重破坏。苏北浅滩受沿岸径流输入影响,盐度变化范围大,青岛海域盐度较稳定,稍高于苏北浅滩。盐度对浒苔微观繁殖体萌发、藻体生长及繁殖过程具有重要作用,通过室内连续受控实验,系统研究了固定盐度(5、10、15、20、25、30、33、35)和变化盐度(盐度逐渐降低)对浒苔微观繁殖体固着、萌发、藻体生长和繁殖不同阶段的影响,主要结论如下:固着阶段,盐度5不利于浒苔微观繁殖体的固着,盐度10～35对微观繁殖体固着的影响不显著,相同盐度下,孢子的固着量显著高于配子。萌发阶段,不同盐度(5～35)及不同盐度变化形式对微观繁殖体(孢子和配子)的萌发没有显著影响,孢子的萌发速度快于配子,最终均能完全萌发。生长阶段,低盐(5～15)不利于浒苔幼苗的生长。繁殖阶段,当盐度≤10时,浒苔不进行生殖活动;盐度15～35范围内,浒苔可以产生微观繁殖体,完成一个完整的生活史;在绿潮形成过程中,孢子的生殖策略为K对策,配子的生殖策略为R对策。上述结论表明,在苏北浅滩和青岛海域,盐度不是限制浒苔发生发展及繁殖过程的关键环境因子,明确了盐度在绿潮发生...     

江苏海区浒苔的营养与食品安全性分析与评价

通过对不同海区浒苔及其与紫菜之间的比较,分析评价了江苏海区定生浒苔和漂浮浒苔的营养特性。通过主成分分析可以将江苏浒苔与其他浒苔和紫菜明显区分开,说明江苏浒苔的营养具有区域一致性。江苏浒苔具有高蛋白、低膳食纤维的特点,浒苔中钙、镁含量高于紫菜,磷含量低于紫菜。江苏浒苔的必需氨基酸含量组成适合人体需要,是良好的蛋白质来源。第一限制氨基酸为甲硫氨酸,呈味氨基酸含量达到氨基酸总量的33.6%—42.9%,具有较好的呈味特性。江苏浒苔的铅、铬离子含量较高,食用风险不容忽视。     

24-表油菜素内酯对浒苔(Ulva prolifera)内源植物激素及相关生理影响

采用植物激素的微量LC-MS检测等方法,研究了24-表油菜素内酯(EBR)对宁波浒苔(Ulva prolifera)内源植物激素含量及其叶绿素荧光参数、可溶性蛋白和糖含量、抗氧化酶活性等的影响。结果表明,浒苔体内含有吲哚乙酸、赤霉素、玉米素、反式玉米素核苷、异戊烯腺嘌呤核苷、茉莉酸等多种促生长性内源植物激素,但不含有异戊烯腺嘌呤。内源植物激素对24-表油菜素内酯的响应程度不同,大多数植物激素在处理第1天含量变化最快。低浓度24-表油菜素内酯处理时,各种内源植物激素的含量增高,均呈现先升高后降低的趋势。0.2 mg/L 24-表油菜素内酯处理组的效果最明显。在该浓度下,24-表油菜素内酯对生长相关激素含量、最大光能转化效率(Fv/Fm)和相对电子传递速率(ETR)、可溶性蛋白和可溶性糖含量、POD活性等均有较大的促进作用;在0.1 mg/L 24-表油菜素内酯处理组中,浒苔的体外抗氧化能力最强。     

改性粘土对浒苔(Ulva prolifera)微观繁殖体去除效果及萌发的影响

本文首先考察了不同浓度改性粘土对浒苔微观繁殖体的去除效果,实验结果显示,去除率随着改性粘土浓度增大而逐渐提高,0.4g/L的改性粘土对初始密度为4.8?105cell/m L的浒苔微观繁殖体去除率可达到80%以上。去除实验后继续研究微观繁殖体的萌发率发现,与对照组相比,不论是上层培养液中还是重新混合后的萌发率均随着改性粘土用量的增加而降低,1.0g/L的改性粘土可使其萌发率由60%左右降至低于6.5%。本文的研究结果表明,适量的改性粘土能有效去除海水中的浒苔微观繁殖体、降低其萌发率,有望成为消除或减弱绿潮灾害的有效手段。     

环境因子对浒苔生长及生源硫释放的影响

近年来,我国黄海海域大规模暴发的绿潮现象对海洋生态环境和海水中的物质迁移转化产生了重要影响。而浒苔作为绿潮暴发过程中的主要藻类,是释放二甲基硫(DMS)的优势藻类,其对海水中硫酸盐吸收转化及生源硫释放发挥着重要作用。本文通过实验室培养探讨了温度、盐度及不同形态氮营养盐对浒苔生长及释放生源硫化物的影响。结果表明,在实验范围内(盐度为25—35,温度为20—25°C),盐度对浒苔生长无明显影响,但盐度增加会促进β-二甲基巯基丙酸内酯(DMSP)的合成。在温度为20°C盐度为35时,DMSP释放达到最大值。温度增加能够促进浒苔的增长,在培养第5天,25°C下浒苔湿重比20°C增加了25%左右。培养液中的DMS含量为20nmol/L左右,约是正常黄海水的4倍,DMSP的浓度更是高于正常海水的数十倍。增加无机氮浓度会促进浒苔的生长及DMS和DMSP的释放,相比之下,NH4+-N比NO3–-N更易被浒苔吸收利用,添加两种氮源组DMS和DMSP的最高含量均比空白组高60%和30%左右。DMS/DMSP的值在10%以内变化,培养过程中DMSP表观降解比AA(丙烯酸)/(AA+DMSP)总体上低于40%。     

黄海绿潮浒苔漂浮生态型的发现与启示

黄海绿潮已经成为常态化发生的海洋生态灾害。遗传分析结果表明,黄海绿潮藻主体由浒苔(Ulva prolifera)的单一群体构成。基于其特殊的基因型、表型,及其占据的独特生态位与生活方式,将其命名为"漂浮生态型"(floating ecotype)。浒苔漂浮生态型的发现,为黄海绿潮关键生态学过程的量化表征提供了重要抓手。基于SCAR特异分子标记的示踪研究表明,在绿潮早期浒苔入海阶段,苏北浅滩紫菜筏架发挥了重要作用;在海上暴发漂移阶段,漂浮生态型在漂浮藻中具有极高的优势度。上述发现提示,黄海绿潮存在重要的生物学成因,应加强针对漂浮生态型适应性特征及其遗传基础的比较研究。鉴于漂浮生态型在山东半岛南岸已零星定殖,提出应关注由于种源北侵和紫菜栽培产业北移带来的潜在风险。上述科学认识对于深刻理解黄海绿潮的成因与发生机制、建立可行的灾害防控措施、科学预测黄海绿潮的演变趋势具有重要意义。     

南黄海浒苔漂移轨迹年际变化规律及驱动因素

综合利用环境卫星(HJ-1A/1B)CCD影像与MODIS影像,对2011-2017年南黄海海域浒苔信息进行了提取,并结合QuickSCAT海风数据以及ESRL海温数据对浒苔生长及漂移路径的影响进行了分析。结果表明:(1)7年中利用遥感手段最初发现浒苔的日期为5月份,初始发现位置多集中在江苏省盐城市附近海域,且近7年浒苔漂移方向整体上向北,进入山东半岛海域。其中,浒苔中心点距离青岛海域最远约115km(2015年6月21日),最近约9.6km(2012年7月11日)。(2)浒苔中心点漂移方位年际差异较大,整体上浒苔漂移路径方向与海面风风向高度一致。(3)SST是浒苔暴发的关键环境因子,南黄海海域5—8月份SST逐月升高为浒苔生消过程提供了环境条件。