核酸环介导等温扩增技术及其在植物检疫中的应用

介绍核酸环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景.环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可部分替代普通PCR,日后伴随着不断改进、完善和标准化,必将在植物检疫上有广阔的应用前景.     

环介导恒温扩增技术（LAMP）及其在植物病毒检测中的研究进展

环介导恒温扩增技术是一种特异、灵敏、简单的新型核酸扩增技术,目前,该技术已经被广泛应用于疾病诊断、食品安全检测及基因芯片等领域。本研究简要介绍了该技术的原理、操作技术及特点,归纳了近些年来该技术在植物病毒（DNA病毒、RNA病毒）、类病毒检测中的应用,并指出了其在应用中呈现的问题及解决办法,最后展望了该技术在植物病害综合防控中的应用前景。     

转基因玉米LAMP检测体系的建立及应用

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法.利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索.结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60 min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍.LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景.     

实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异的引物和探针，对玉米中的内源基因Invertase和转基因玉米Mon 810、Event 176中的外源基因进行了定量检测，建立了商业化转基因玉米Mon 810 (YieldGard)和Event 176 (Maximizer)的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度小于0.01％，是国际上设定的转基因最低限量的100倍。     

转基因玉米培育及其检测技术应用研究

玉米是全球和我国第一大粮食作物,对稳定我国粮食安全具有显著的贡献。随着农杆菌介导法等转基因技术在玉米转基因育种中的应用,能够有效培育抗虫转基因玉米、耐除草剂转基因玉米、耐干旱和品质改良转基因玉米。同时,通过将多基因聚合转化和常规玉米育种技术相结合,研究建立快速有效的玉米转基因检测技术,有助于不断培育优良性状的玉米新品种,促进我国玉米种业发展和乡村振兴。     

精子介导转基因技术研究进展

精子因在授精中的独特作用而被认为是携带外源DNA的理想载体。以精子作为载体制备转基因动物技术以其操作简单、成本低廉、便于大量筛选等优点受到人们的高度重视。文章主要介绍了精子介导基因转移制备转基因动物的基本原理、发展过程、最新研究进展及目前存在的问题。     

低能离子束介导转基因技术

遗传转化是基因工程的一个重要研究方向。目前，已经应用于植物转基因的方法有10种以上，常用的有农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、花粉管通道法等。这些转基因方法各有优缺点。为了使转化技术更加完善和成热，科学家们一直在不断探索，寻求方便、高效的转化方法。     

LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用

以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作.结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当.所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测.     

玉米根腐病菌麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测方法

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一,旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先,根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物;然后,针对该引物组筛选了其最佳反应温度,检测了LAMP反应的特异性和灵敏度,并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明,本研究设计的引物组在61～68℃条件下均能实现对靶标基因的扩增,其中以66℃为最佳反应温度;在特异性检测中,引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢;在灵敏度检测中,对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下,25 min左右即可实现扩增;在对玉米根腐病样本检测中,在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。     

基于qPCR和LAMP技术的马铃薯晚疫病菌快速检测方法

马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）能侵染多种茄科植物,它引起的马铃薯晚疫病,是马铃薯生产中的第一大病害。为了开发能在田间快速检测马铃薯晚疫病病原的方法,利用P. infestans T30-4基因组测序数据的contig 1.18131,设计qPCR和LAMP引物,优化扩增条件后得到引物的特异性和灵敏度,最后通过检测田间收获薯块,比较形态学传统方法、qPCR及LAMP的差异。特异性检测结果发现,qPCR和LAMP仅在含有P. infestans DNA模板的体系有阳性扩增,在寄主和其他微生物DNA中均无扩增;在优化的条件下,qPCR和LAMP的检测下限可达1×10 ^-6ng/μL,在有寄主和其他微生物DNA存在的条件下,引物的灵敏度没有显著差异。利用两种快速方法对在大理、丽江及昆明3个地区田间收获薯块上检测发现,qPCR和LAMP方法得到的检出率差异极为不显著（P=0.420）,两种快速检测方法和形态学鉴定方法检出率差异极显著（P=0.009）。在大理、丽江及昆明3个地区的薯块中,两种分子检测方法检出率均比形态学方法高。其中,qPCR检测方法比形态学方法分别提高了12.00%、2.00%、8.70%;LAMP检测方法比形态学方法分别提高了11.30%、2.00%、8.70%。     

转基因抗虫玉米的定量检测

建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为：3.13%、1.09%、0.53%（SYBR Green I法）和3.07%、1.02%、0.50%（Taqman探针法）,RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。     

甜瓜种子中黄瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒的RT-LAMP可视化检测方法

本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。     

转基因玉米目标基因纯合体快速准确的PCR鉴定方法(英文)

本文以转基因玉米NK603为例,介绍了一种检测目标基因纯和体的PCR方法.该方法利用4个引物的多重PCR反应,这4个PCR引物分别来自于目标基因的5'端(5'TP)和3'端(3'TP)DNA序列,目标基因5'端一侧的玉米基因组DNA序列(5'GP),以及目标基因3'端一侧的玉米基因组DNA序列(3'GP).视玉米个体有无目标基因以及目标基因的杂合/纯和状态,PCR扩增可得到三种不同的结果:如果被检测个体无目标基因,5'GP与3'GP间的玉米基因组DNA将被扩增,PCR只产生一条条带:如果被检测个体是目标基因的纯合体,5'GP与5'TP及3'TP与3'GP间的DNA将被扩增,PCR则产生两条条带;如果被检测个体是目标基因的杂合体,5'GP与3'GP、5'GP与5'TP以及3'TP与3'GP间的DNA将都被扩增,PCR则产生三条条带.三条不同长短的PCR产物条带在琼脂糖凝胶上清晰可分,易于辨别.和费时昂贵的定量PCR相比,该方法简单、快速、结果准确,在目标基因位点玉米基因组DNA序列已知的前提下,该方法可扩展到诸如Btll、Event176、GA21、MON810、MON863和TC1507等任何转基因玉米的回交转育程序中.     

以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017

根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。     

花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子在转基因棉花中的表达

利用GUS作为报告基因，通过GUS组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚，R0代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚GUS基因表达情况，详细阐述了CaMV 35S启动子在棉花细胞中的表达轮廓。结果表明，在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中GUS基因能稳定表达并遗传给后代细胞；在根、茎、叶细胞中检测到GUS表达活性。在     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。