传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病病毒(IBDV)蛋白VP4在抑制宿主免疫应答中起重要作用,为制备IBDV VP4的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-VP4免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、筛选、亚克隆后获得4株能稳定分泌抗VP4的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为3B3、3H11、4C8和4G6,经间接ELISA测定4株单抗的亲和力解离常数分别为4.61×10–11、1.71×10–10、4.26×10–11和5.02×10–11,均为高亲和力抗体。4株单抗的重链类型分别为Ig G1、Ig G1、Ig G2b和Ig G1。进一步以Western blotting鉴定,该4株单抗均能特异地识别IBDV的VP4蛋白,间接免疫荧光和Western blotting试验表明4株单抗均能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP4蛋白。该单抗为检测IBDV以及研究IBDV VP4的生物学作用奠定了基础。     

草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的研究

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是当前引起我国草鱼出血病的主要病原,其外衣壳蛋白通常在病毒的组织嗜性和细胞嗜性上发挥重要作用。本研究利用共定位、Dot-Blot技术和His-Pull Down技术,验证了草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用。将pDsRed1N1-VP7,pDsRed1N1-VP56分别与pEGFP-Fibulin-4共转染草鱼性腺细胞GCO。结果显示,病毒蛋白VP7,VP56和草鱼蛋白Fibulin-4均分布于细胞质中,两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠。应用Dot-Blot Overlay技术,将纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上,经过His-VP7,His-VP56蛋白的孵育,结果表明随着杂交的蛋白量从低到高,蛋白信号由弱到强,His-VP7与His-VP56都能够吸附于GST-Fibulin-4蛋白上并发生相互作用,而不能吸附GST蛋白。利用Pull Down技术,裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白,结合His-VP7,His-VP56的HisPur Cobalt Resin,在Elution中均能检测到GFP-Fibulin-4蛋白质,而检测不到对照蛋白质GFP,进一步证实了VP7,VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用。     

利用噬菌体展示技术淘选草鱼呼肠孤病毒的单链抗体

草鱼呼肠孤病毒（GCRV）是引起我国大面积草鱼幼鱼出血病暴发的主要病原,其外衣壳蛋白VP5和VP7在病毒入侵宿主细胞过程中起着至关重要的作用。研究以原核表达的VP7、全长VP5、VP5的N端片段及C端片段为靶蛋白,利用已构建的噬菌体展示单链抗体文库进行淘选。经过3轮淘选后,共获得7个针对VP7、VP5、VP5N和VP5C的单链抗体。经过验证,识别原核表达的VP7的两个单链抗体能够成功识别天然GCRV病毒。此结果对于进一步研究GCRV与宿主细胞的相互作用机理奠定了基础。       

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7真核重组质粒的构建及免疫效果评价

为研究开发草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)基因疫苗, 以编码其主要衣壳蛋白VP7的序列为靶基因, 克隆构建了真核表达重组质粒 pEGFP-N1-VP7。用脂质体法将其转染真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达, 荧光显微镜观察及特异性RT-PCR检测结果表明, 成功转染并得到了高效表达。大量扩增重组菌, 提取并制备重组质粒pEGFP-N1-VP7, 肌肉注射免疫(205) g的健康草鱼, 重组质粒按0.5和5 g分为2组, 同时设5 g空载体组及对照组。免疫草鱼22d后, 检测草鱼肠、外周血、肾脏、脾脏的呼吸暴发活性及淋巴细胞的增殖反应; 免疫草鱼21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后, 分别尾静脉采血并分离血清, 用双抗体夹心ELISA方法进行抗体水平的测定。结果表明, 构建的含VP7蛋白的核酸疫苗既可诱导草鱼的细胞免疫, 又可诱导特异性体液免疫, 具有明显的免疫应答作用。按照每尾0.5 g重组质粒的剂量免疫草鱼后35d进行攻毒, 免疫保护率达到67%, 此研究为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。       

草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发生的研究

以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾细胞系(CIK)为模型,进行了草鱼呼肠孤病毒在细胞内的形态发生的研究.当病毒以感染复数为5～10PFU/CELL感染CIK细胞时,在病毒感染细胞4h以内的切片中,可观察到脱去部分外层衣壳的不完整病毒颗粒.感染细胞8h,可观察到浆胞内病毒发生基质,其内含有大量的直径约50nm的亚病毒颗粒,无外层蛋白结构.感染12～16h后,这些亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构,形成直径为72nm左右的成熟的病毒粒子.病毒感染细胞8h后,开始出现典型的病毒包含体,16～20h小时病毒包含体裂解,继而释放出有感染性的子代病毒颗粒.该结果有助于对GCRV致病机理的了解.     

抗传染性法氏囊病病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

原核表达的IBDVGx-VP5蛋白经纯化后免疫8周龄的BALB/c雌性小鼠,三次基础免疫后,融合前加强免疫,取脾细胞在PEG(MW1500)的作用下与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经过三次亚克隆筛选,获得稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为4B4、6D12、3E8,以三株杂交瘤细胞制备的腹水ELISA效价分别为5×104、3.5×104、3×104,特异性实验表明三株单抗能与IBDVGt株反应。以单抗介导的间接免疫荧光检测表达Gt-VP5的VeroE6细胞,可以见到特异的荧光,能做为特异性的检测VP5蛋白的工具,为今后IBDVVP5蛋白的研究打下基础。     

草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

草鱼呼肠孤病毒的三维重构与衣壳蛋白特性

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)为呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属一新成员. 最新的基因组序列分析发现, GCRV与哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian reovirus, MRV)具有高度的同源性. 为了解GCRV致病机理, 进行了分辨率达到17 Å的三维重构与衣壳蛋白特性研究. 结果表明: GCRV颗粒呈多层排列, 包括RNA核心与内壳层、中间层及外壳层. 由200个按T = 13对称排列的三聚体组成外衣壳, 其典型特征是在5次轴上出现三聚体缺失凹陷区, 暴露出中间层三聚体亚单位. 内壳层由120个单体组成, 按T = 1排列, 结构特点与呼肠孤病毒科成员内衣壳特征相一致. 衣壳蛋白电泳显示, GCRV颗粒含有7种蛋白(VP1-VP7)组分, 与MRV衣壳蛋白特性相近, 两者在衣壳结构组成上的相似性与基因组序列的高度同源性相吻合. 此结果对进一步研究GCRV与宿主细胞相互作用机理具有指导意义.     

抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的制备及鉴定

利用具有中和活性的抗鳗弧菌单克隆抗体 4A6作为免疫原 ,通过单克隆抗体技术制备出 7株分泌抗独特型单抗的杂交瘤细胞。以ELISA竞争抑制实验及诱导Ab3的功能实验证实 ,其中 4株属于Ab2 β,有可能用于疫苗生产。     

草鱼IL-10单克隆抗体的制备与鉴定

白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)参与机体免疫应答调节, 协同其他细胞因子维持免疫系统稳态。为探究草鱼(Ctenopharyngodon idella)IL-10的细胞来源, 研究利用大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)表达系统制备了高纯度的草鱼IL-10重组蛋白, 免疫小鼠制备单克隆抗体后通过免疫印迹、激光共聚焦和流式细胞术对抗体进行分析。结果表明, 获得的单克隆抗体不仅能特异识别大肠杆菌表达的CiIL-10重组蛋白, 而且能识别HEK293细胞中表达的真核IL-10重组蛋白。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和草鱼白细胞介素1β(IL-1β)刺激草鱼性腺细胞系(GCO)36h的免疫荧光染色分析表明, 草鱼IL-10单克隆抗体能与草鱼内源IL-10结合, 但IL-10阳性细胞数量在LPS处理前后无明显变化。该研究成功制备了高纯度CiIL-10重组蛋白, 获得了特异性好的高质量单克隆抗体, 为研究草鱼ILC2和Th2细胞的增殖、分化和功能奠定了基础。     

Tropic1808基因重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：用Tropic1808基因重组蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤（SP2/0）细胞融合,经ELISA筛选和有限稀释法获得分泌单克隆抗体的细胞株,Western Blot等方法对其生物学特性进行鉴定。结果：获得2株识别Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体的细胞株Ⅱ4B、Ⅲ4C。WesternBlot法显示该抗体特异性地识别Tropic1808基因重组蛋白;ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清及体内成瘤后产生的腹水的抗体效价分别为1：80、1：600;杂交瘤细胞染色体数平均为90-100;亚类鉴定单抗的重链为小鼠IgG1,轻链为κ型。结论：成功地制备了Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Tropic1808基因重组蛋白的功能提供了良好的基础。     

IHNV单克隆抗体的制备及其初步应用

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南方鲇免疫球蛋白单克隆抗体的制备及特性

采用PEG沉淀结合Sepharose-4B柱层析法分离纯化了健康非免疫状态下南方鲇血清免疫球蛋白,在SDS-PAGE电泳条件下血清免疫球蛋白重链和轻链的分子量分别约为77 kD和27 kD。应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了4个南方鲇免疫球蛋白特异性的单克隆抗体细胞株,并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。经抗体亚级份测定,其中IgG1有2株,IgG2a有1株,IgG2b有1株;抗体滴度为104—106,有三株单抗具有Western-blot反应特性,识别南方鲇免疫球蛋白的重链。4株单抗都能特异地识别南方鲇、鲇的免疫球蛋白,而与鲫、草鱼、罗非鱼、斑点叉尾、光泽黄颡鱼血清以及水产动物常见病原菌如气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌、柱状屈桡杆菌、沙门氏菌及大肠杆菌等无任何交叉反应。单克隆抗体F4-A12对纯化的南方鲇免疫球蛋白的检测灵敏度为31 ng。实验结果证明这些单抗具有高度特异、高度灵敏等特点,可用于南方鲇免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断,具有广阔的应用前景。     

小鼠抗天花粉蛋白IgE单克隆抗体的制备、分离和鉴定(英文)

天花粉蛋白是中药天花粉的有效引产成份,在应用中它偶尔也引起过敏反应。我们用杂交瘤技术建立了一株分泌抗天花粉蛋白特异性IgE单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在实验中,二次免疫的C57 BL/6 J小鼠的肠系膜淋巴结细胞和脾细胞分别被用来同NSI骨髓瘤细胞进行融合。虽然在融合前动物血清IgE抗体效价仅为40～160 PCA滴度,但用肠系膜淋巴结细胞进行的4次融合都产生了IgE杂交瘤。阳性率为1.0-6.7%。对比之下,用脾细胞进行的另外两次融合却没有观察到IgE杂交瘤产生,统计结果说明差异显著(P<0.05)。该IgE单克隆抗体可以在体内和体外诱发大鼠肥大细胞脱颗粒。56℃热处理2小时能使该抗体诱导PCA反应的能力完全丧失,然而却不影响其结合抗原的能力。对该单克隆抗体的特异性的鉴定表明,它可以特异性地识别精制天花粉蛋白和结晶天花粉蛋白上的抗原决定簇。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体和免疫酶技术研究

采用蛋白质连接技术合成玉米赤霉烯酮抗原,免疫Balb/c鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术建立六株分泌抗玉米赤霉烯酮的单克隆抗体杂交瘤细胞株。间接酶联免疫吸附试验测定细胞上清抗体效价为1:2084(4H8)、1:256(6H9、4H3、2H5、2C8)、1:16(3F10);腹水抗体效价为10~9(4H3、4H8)、10~8(2H5)、10~7(6H9)、10~5(3H10)。竞争间接酶联免疫吸附试验测定六株单克隆抗体对玉米赤霉烯酮的敏感度为0.3—0.8ng/ml。六株抗体与玉米亦霉烯醇的交叉反应率为1.3—9.0％。六株单克隆抗体均属IgG类。细胞体外传代培养和冻存复苏后分泌抗体稳定。纯化抗体在37℃保存12天稳定,-30℃保存90天抗体滴度不变。用该抗体建立竞争间接酶联免疫吸附试验检测掺合玉米赤霉烯酮的玉米、小麦、饲料,平均回收率分别为105％、90％、103％,平均批间变异系数为5.8％、2.8％、6.8％,批内变异系数为3.8％、12.7％、15.7％。样品中玉米赤霉烯酮掺合量与竞争间接酶联免疫吸附试验检出量有良好相关性(r≥0.9996)。     

长叶车前花叶病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型中的应用

应用细胞杂交技术,将长叶车前花叶病毒杭州分离株(RMVha)、烟草花叶病毒普通株(TMVc)和北京番茄株(TMVbe-t)免疫的Balb/c小鼠脾细胞与Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选测定,成功地获得了5株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株属于IgG_(2b),其余4株均属于IgG_(?),5株细胞株均制备了腹水抗体,ELISA效价最高达256000,琼脂双扩散效价达128,根据与15个不同RMV和TMV毒株的反应特性,可将5株单克隆抗体分为A、B、C三组,分别针对a、b、c三个不同的抗原决定簇。根据三组单克隆抗体反应性的差异,15个毒株可分为8个血清型,本文讨论了所获得的5株杂交瘤细胞在植物病毒的诊断、病毒病原的鉴定及病毒分型方面的应用价值。     

草鱼催乳素抗血清的制备与鉴定

应用从草鱼垂体中分离纯化的催乳素免疫兔子制备了特异抗血清。用常规酶联免疫吸附测定法检测表明该抗血清与马哈鱼生长激素及促性腺激素完全没有交叉反应，而与草鱼生长湟级向弱交叉反应。免疫细胞化学染色表明该抗血清主要与草鱼垂体前叶催乳素细胞发生结合反应，与垂体间叶细胞有微弱染色反应，但与神经垂体琢垂体后叶细胞则完全没有免疫结合反应。