pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

目的：利用基因工程技术构建pmRNA IRES—hKDR（Ig1-3）重组质粒，为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础。方法：以本实验室构建保存的pcDNA3．1hKDR为模板，PCR扩增hKDR（Ig1-3）eDNA片段后用Nco Ⅰ和XhoⅠ酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中，经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性，然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA，用脂质体转染COS-7细胞，经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白。结果：PCR、酶切和测序证实pmRNAIRES—hKDR（Ig1-3）构建成功，体外转录出相应的mRNA，免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达。结论：成功构建含pmRNAIRES—hKDR（Ig1-3）的真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒,为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础.方法:以本实验室构建保存的pcDNA3.1 hKDR为模板,PCR扩增hKDR(Ig1-3)cDNA片段后用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中,经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性,然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA,用脂质体转染COS-7细胞,经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白.结果:PCR、酶切和测序证实pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)构建成功,体外转录出相应的mRNA,免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达.结论:成功构建含pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)的真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

重组蛋白高产的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)工程株的构建

利用基因寻靶技术构建了高产外源蛋白的中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)工程株。将携带 lox P-绿色荧光蛋白融合基因(lox P-GFP)和二氢叶酸还原酶 (DHFR)基因的质粒转染DHFR缺陷型 CHO细胞后 ,根据荧光强度筛选细胞群落。选择出的 16个克隆子 ,能高水平表达 GFP蛋白 ,并且在它们的染色体上携带一个拷贝的质粒 ,将它们用甲氨蝶呤(MTX)处理后可以检查它们由 DHF R介导的基因扩增能力。其中 MK1和 MK2两个克隆子在基因扩增时 GFP表达量得到提高。利用这种细胞 -载体系统 ,可以通过基因寻靶和基因扩增反复获得重组蛋白的高产株。在人单克…     

pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达

目的：摸索真核细胞翻译启动因子5A（eIF5A）编码基因的合成、pcDNA3．1／eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达。方法：用PCR合成eIF5A基因，将基因分别接在克隆载体pMD18-T的EcoR V多克隆位点上和真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ的多克隆位点之间，构建eIF5A基因的克隆载体和真核表达载体，分别在大肠杆菌E．coli DH5α中转化并提取质粒，将真核表达载体pcDNA3．1／eIF5A的质粒提取后，用脂质体包合并转染真核细胞CCRF-CEM，用流式细胞仪对eIF5A的表达水平进行检测。结果：eIF5A在CCRF-CEM细胞中的表达水平为107．03，eIF5A在转染细胞CCRF-CEM／trans中的表达水平为114．27，表达升高。结论：本实验构建了pcDNA3．1／eIF5A真核表达载体，发现其在CCRF-CEM细胞中高表达。本实验结果将有助于探讨肿瘤治疗过程中的新靶标。     

抗血小板单克隆抗体重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:在原核细胞中表达抗血小板Fab抗体,为研制治疗性抗血小板抗体奠定基础.方法:从含有抗血小板抗体轻链基因和重链Fd段基因的克隆载体pGEM T-Easy上经双酶切获得抗体轻链基因和重链Fd段基因片段,将其以特定位点分别插入噬菌体抗体表达载体p3MH上,构建原核表达重组质粒p3MH/P140κ-Fd.转化E. coli XLI-Blu感受态细胞,并进行诱导表达,用ELISA方法进行鉴定.结果:血小板抗体轻链基因和重链Fd段基因片段准确插入p3MH载体,重组质粒在大肠杆菌表达的上清中含有与血小板特异性结合的Fab抗体.结论:在原核细胞中成功克隆并高效表达了可溶性的抗血小板Fab抗体.     

抗血小板单克隆抗体重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:在原核细胞中表达抗血小板Fab抗体,为研制治疗性抗血小板抗体奠定基础.方法:从含有抗血小板抗体轻链基因和重链Fd段基因的克隆载体pGEM T-Easy上经双酶切获得抗体轻链基因和重链Fd段基因片段,将其以特定位点分别插入噬菌体抗体表达载体p3MH上,构建原核表达重组质粒p3MH/P140κ-Fd.转化E. coli XLI-Blu感受态细胞,并进行诱导表达,用ELISA方法进行鉴定.结果:血小板抗体轻链基因和重链Fd段基因片段准确插入p3MH载体,重组质粒在大肠杆菌表达的上清中含有与血小板特异性结合的Fab抗体.结论:在原核细胞中成功克隆并高效表达了可溶性的抗血小板Fab抗体.     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

活化的蛋白激酶C受体1在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的研究活化的蛋白激酶C受体1(RACK1)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及意义。方法采用免疫组织化学EnVision法检测RACK1及甲状腺转录因子-1(TTF-1)蛋白在123例NSCLC(包括组织学标本80份和胸腔积液细胞学标本43份)和50份正常肺组织中的表达情况。结果①RACK1和TTF-1蛋白在NSCLC癌组织中的阳性率分别为48.8%和42.5%,与正常肺组织阳性率4.0%和100.0%相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在癌组织学标本中,RACK1和TTF-1蛋白在肺腺癌中的阳性率分别为87.5%和80.0%。在细胞学标本中,RACK1和TTF-1蛋白在肺腺癌中的阳性率分别为94.1%和85.3%。RACK1和TTF-1在肺腺癌中的表达率明显高于鳞癌和其他类型,其表达与组织学类型相关(P<0.05)。②RACK1蛋白诊断肺腺癌的灵敏度和特异度分别为90.5%和89.8%,TTF-1的灵敏度和特异度分别82.4%和95.9%。③在40例肺腺癌组织中,RACK1蛋白的表达与吸烟情况、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 RACK1促进了肺腺癌的发生、发展,其高表达可能提示患者预后不良,可能是较TTF-1更为敏感的肺腺癌诊断标记。     

MMP-2和CD_(44)V_6基因蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及临床意义

目的探讨MMP-2和CD_(44)V_6的表达与卵巢浆液性肿瘤侵袭和转移的关系。方法应用流式细胞免疫法定量检测MMP-2和CD_(44)V_6在45例卵巢浆液性肿瘤中的表达。结果MMP-2在卵巢浆液性癌中的表达明显高于卵巢浆液性瘤(P<0.05),且与卵巢浆液性癌组织分级和临床分期密切相关(P<0.05)。CD_(44)V_6在卵巢浆液性癌中的表达明显高于卵巢浆液性瘤(P<0.05),且与卵巢浆液性癌组织分级和临床分期密切相关(P<0.05)。MMP-2和CD_(44)V_6在卵巢浆液性癌中的表达密切相关(P<0.05)。结论卵巢浆液性癌中MMP-2和CD_(44)V_6的高表达促进了癌的侵袭和转移,MMP-2和CD_(44)V_6在卵巢浆液性癌中的表达有相关性。提示MMP-2和CD_(44)V_6的共同检测可作为诊断和判断预后的参考指标。     

大鼠糖皮质激素受体基因腺病毒载体的构建及在肾系膜细胞中的表达

目的 利用AdEasy系统构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因重组腺病毒载体,转染大鼠肾小球系膜细胞(GMC),并通过Western Blot法检测GR蛋白的表达.方法 将质粒pcDNA1 Neo-Rat GR扩增、凝胶回收获得的Rat GR cDNA双酶切片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pShuttle-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-Rat GR,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内经同源重组得到腺病毒重组质粒pAd-Rat GR,经人胚肾293A细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-Rat GR;用包装后的病毒上清转染大鼠GMC,提取细胞中总蛋白,通过Western Blot方法 检测GR蛋白的表达.结果 连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-Rat GR重组质粒,经人胚肾293细胞包装,48 h后观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得1×109 PFU /ml 滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-Rat GR,转染大鼠GMC 48 h后提取细胞总蛋白,Western Blot检测GR蛋白有明显表达.结论 构建的大鼠GR基因腺病毒载体能够在大鼠GMC 中表达GR蛋白,并有上调作用.     

人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行鉴定。方法:将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ADPN,并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。结果:PCR获得长度为753bp目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与GenBank检索的人脂联素cDNA序列(Accession NM-004797)100%匹配;含重组Adiponectin质粒的大肠杆菌经0.4mmol/L的IPTG诱导6h后有表达。结论:应用并成功构建了人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN,且在大肠杆菌中获得有效表达。     

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。     

可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1在类风湿关节炎患者血清中的表达及意义

目的 探讨可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1(sTREM-1)在类风湿性关节炎(RA)患者血清中的表达及与RA病情活动的相关性.方法 80例RA患者(病例组)中,稳定期RA患者15例,活动期RA患者65例.选取健康体检者74名作为对照组.采用酶联免疫吸附试验检测研究对象血清sTREM-1的表达水平,并探讨sTREM-1与患者病史、疼痛关节数、肿胀关节数、红细胞沉降率、高敏C反应蛋白、类风湿因子及抗环瓜氨酸肽抗体的相关关系.结果 RA患者血清中sTREM-1的表达水平高于正常对照组,差异具有统计学意义[(3.2±1.3)μg/L比(2.6±1.4) μg/L,t =2.94,P ＜0.05];活动期RA患者血清sTREM-1的表达水平高于稳定期,差异具有统计学意义[(3.3±1.2)μg/L比(0.9±0.6)μg/L,t=4.50,P＜0.05];出现双手关节X线损害(放射学评分达2级或2级以上)的RA患者血清sTREM-1表达水平明显高于无双手关节X线损害者[(3.7±1.1) μg/L比(2.5±1.1)μg/L,t =4.52,P＜0.01];病例组sTREM-1的表达水平与疾病活动性评分( DAS28)具有明显的相关性(r=0.8500,P＜0.01),且与RA关节肿胀数、红细胞沉降率、类风湿因子、抗环瓜氨酸肽抗体呈正相关(r值分别为0.6412、0.8263、0.4421、0.6635,均P＜0.01).结论 RA患者血清中sTREM-1呈高表达,血清sTREM-1水平可作为反映RA病情活动的指标.     

多巴胺D1受体在Sf9昆虫细胞中的表达及左旋氯代斯阔任对重组D1受体的激动作用

目的:在Sf9昆虫细胞中表达D_1受体,并研究左旋氯代斯阔任对重组D_1受体的激动作用。方法:构建含D_1受体cDNA的重组杆状病毒,以其感染Sf9昆虫细胞得到D_1受体表达。[~3H]SCH23390受体结合检测重组D_1受体的药理特性。[~3H]SCH23390受体结合和cAMP测定实验检测左旋氯代斯阔任对重组D_1受体的激动作用。结果:在Sf9昆虫细胞中成功表达D_1受体,[~3H]SCH23390与重组D_1受体最大结合量(B_(max))为(0.94±0.06)nmol/g蛋白,[~3H]SCH23390与重组D_1受体的结合解离常数(K_d)为(1.9±0.3)nmol/L,其药理特性与小牛纹状体脑匀浆所得结果一致。左旋氯代斯阔任对重组D_1受体有高亲和力,解离常数K_i为(6.3±1.4)nmol/L;并剂量依赖地引起胞内cAMP增加,EC_(50)为0.72μmol/L(95％可信限为0.67-0.77μmol/L),表现出D_1激动作用。结论:在杆状病毒/昆虫细胞Sf9中,成功建立了D_1受体异源表达系统。在细胞分子水平,直接证实了左旋氯代斯阔任对D_1受体的激动作用。     

细胞周期素D1和磷酸酶基因蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及与临床病理特征的关系

目的探讨喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中细胞周期素D1（CyclinD1）和磷酸酶基因（PTEN）蛋白的表达及其与临床病理特征的关系。方法应用免疫组化方法检测50例LSCC组织、20例不典型增生（AH）、15例声带息肉（VCP）和10例正常喉黏膜（NLM）组织中CyclinD,和PTEN蛋白表达水平,并结合临床病理特征进行分析。结果在LSCC中CyclinD、和PTEN表达阳性率分别为62．O％和48．0％。LSCC中CyclinD,表达阳性率高于AH、VCP和NLM,而PTEN表达阳性率低于AH、VCP和NLM（P〈0．05）。CyclinD,和PTEN表达与LSCC分级程度、临床分期和颈部淋巴结转移相关（P〈0．05）。LSCC中CyclinD,表达与PTEN表达呈显著负相关（r=-0．32,P〈0．05）。结论联合检测CyclinD。和PTEN蛋白的表达对提示LSCC恶性程度、临床进展和预测颈部淋巴结转移具有重要意义。     

CXC趋化因子受体4及基质细胞衍生因子1在宫颈癌组织中的表达及其与化疗药物敏感性之间的关系

目的研究CXC趋化因子受体4(CXCR4)及基质细胞衍生因子1(SDF)-1在宫颈癌组织中的表达情况,及其与宫颈癌常规化疗药物敏感性之间的关系。方法收集山西医科大学第一医院2017年6月至2018年6月手术切除的宫颈癌组织新鲜标本40例,采用MTT法检测原代培养宫颈癌细胞对顺铂、环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶的体外药物敏感性,蛋白印迹法检测癌组织中CXCR4及SDF-1的表达情况,分析CXCR4及SDF-1的表达与药物敏感性之间的关系。结果不同宫颈癌细胞体外对化疗药物敏感性存在差异,紫杉醇,顺铂,5-氟尿嘧啶及环磷酰胺的平均抑制率分别为:65±11、52±10、32±12、19±7,差异有统计学意义(P<0.05);与癌旁组织相比,CXCR4及SDF-1在宫颈癌组织中的表达显著增高(P<0.05),CXCR4及SDF-1的表达与肿瘤的分化程度及临床分期有关(P<0.05)。CXCR4及SDF-1在紫杉醇耐药组中的表达显著高于敏感组(P<0.05),SDF-1在顺铂耐药组中的表达显著高于敏感组(P<0.05)。结论 MTT药敏实验对宫颈癌化疗药物的选择具有一定的参考价值,CXCR4及SDF-1在宫颈癌中表达上调,可能与紫杉醇及顺铂的耐药有关。     

N?myc下游调控基因 2蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及对人喉表皮样癌细胞生物学特性的影响

目的检测 N?myc下游调控基因 2(N?myc downstream regulated gene 2,NDRG2)在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其人类上皮细胞 2型((Human Epithelial cells of type 2)对人喉表皮样癌细胞(Hep?2细胞)侵袭的影响。方法收集西安交通大学第一附属医院 2014年 1月 1日至 2017年 12月 31日接受喉部分切除术的病人,共计 41例喉鳞状细胞癌组织及癌旁组织。采用免疫组织化学检测喉鳞状细胞癌组织中 NDRG2的表达, χ2检验分析不同临床病理特征分组中 NDRG2阳性率的差异;实时定量聚合酶链式反应及蛋白质印迹法检测喉鳞状细胞癌 Hep?2细胞中 NDRG2的表达水平; Transwell检测 NDRG2对 Hep?2细胞侵袭及转移的影响。结果 41例喉鳞状细胞癌组织中 NDRG2的阳性率明显低于癌旁组织,(χ2=30.781,P＜0.05)TNM III期和 IV期及淋巴结转移的喉鳞状细胞癌病人中 NDRG2的阳性率低于 TNM I期和 II期及未发生转移的病人(TNM I和 TNM II NDRG2阳性率: 37.500%,TNM III和 IV NDRG2阳性率: 5.882%,χ2=5.394,P＜0.05;无淋巴结转移病人 NDRG2阳性率:55.556%,有淋巴结转移病人 NDRG2阳性率: 15.625,χ2=6.073,P＜0.05)。此外, Hep?2细胞中 NDRG2的表达也明显低于正常鼻咽上皮 NP?69细胞［Hep?2(1.193±0.053),NP?69(0.238±0.072),t=3.536,P＜0.05］。上调 Hep?2细胞中 NDRG2的表达后,转移［Lv?control(141.328±23.424)个, Lv?NDRG2(54.925±16.825)个, t=4.413,P＜0.05］及侵袭［Lv?control(71.782±18.675)个, Lv? NDRG2(25.931±9.729)个, t=3.757,P＜0.05］细胞数目显著降低。结论 NDRG2在喉鳞状细胞癌组织及细胞中低表达,并可作为抑癌基因抑制 Hep?2细胞增殖、侵袭及转移。     

DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白的构建表达及特异性细胞毒性研究*

目的构建重组毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,探讨其对过度表达αMSH受体的几种癌细胞的特异杀伤作用.方法利用含有His·Tag和白喉毒素的基因序列作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2的互补序列基因作下游引物,以pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板,PCR扩增得到DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段,插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH.用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白,用结晶紫法检测重组蛋白对几种癌细胞和正常细胞的毒性作用.结果构建了含有His·Tag重组表达质粒pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH;SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45.32×103,其表达量占菌体蛋白总量的29.2%;Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合;细胞活性检测表明重组蛋白对SP2/0,HeLa,A549,A375这4种癌细胞有明显的杀伤作用,4种癌细胞的IC50值分别是3.138,2.736,7.243和4.672 μg·mL-1.结论成功构建了具有生物学活性的重组蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,为进一步的靶向性药物研究奠定了基础.