人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

基于定量构效关系预测血管紧张素转化酶抑制剂活性

应用启发式方法和支持向量机方法建立了114种血管紧张素转化酶抑制剂活性定量构效关系模型,研究了分子结构对抑制剂活性的影响.2种方法均得到了较好的结果,交互检验的相关系数平方分别为0.72和0.82.通过对模型的稳定性和预测能力比较,发现支持向量机建立QSAR模型能够更好地预测血管紧张素转化酶抑制剂活性.     

Alcalase水解泥鳅蛋白制备降压肽工艺研究

以泥鳅肉水解产物对血管紧张素转化酶（ACE）的抑制率、水解度（DH）以及水解产物的肽含量为指标,从碱性蛋白酶、碱性内切酶（Alcalase）、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶5种酶中筛选出碱性内切酶作为酶解泥鳅蛋白制备降血压肽的最适水解酶。在单因素试验基础上,采用响应面实验对该酶的酶解条件进行优化,得出最佳水解条件为：时间60min,pH 8.1,温度45℃,酶底物比（E/S）1 900U/g,固液比1∶15。在该条件下水解,得到酶解物的ACE半抑制质量浓度IC50值为0.22mg/mL。 更多还原     

SHP-2蛋白NSH2结构域的原核表达和同位素标记

SHP-2蛋白是一种含有两个SH2结构域的磷酸酶。SHP-2的N端SH2结构域是细胞因子或病毒因子激活该蛋白的分子内靶点。对shp2基因进行信息学分析,设计引物通过PCR克隆出人SHP-2蛋白N端SH2结构域(NSH2)的DNA序列。重组到原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效率表达了可溶性NSH2蛋白。对蛋白进行15N同位素标记和纯化,并浓缩获得达到进行核磁滴定法结构研究的蛋白样品。     

小麦麦谷蛋白高分子量亚基N端序列克隆及原核表达分析

为了探究麦谷蛋白高分子量亚基(HMW-GS)的N-末端结构域对面粉品质的影响,以HMW-GS的1Dx5的N-末端结构域(1Dx5-N)为目的基因进行序列克隆及原核表达,研究大肠杆菌BL21(DE₃)为载体菌进行转化,鉴定阳性克隆,以IPTG和乳糖作为诱导剂,并通过正交试验,筛选最佳的诱导条件。结果表明：1Dx5-N序列基因全长267 bp,共编码氨基酸89个,预测分子质量为16.211 kDa;经转化、阳性克隆鉴定后,证明了该表达载体能够在大肠杆菌中稳定遗传;IPTG和乳糖均可诱导1Dx5-N进行表达;SDS-PAGE表明1Dx5-N重组蛋白多为包涵体蛋白;IPTG诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃,浓度0.6 mmol/L,诱导时间16 h;乳糖诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃、质量浓度9 g/L、诱导时间16 h。通过对比发现,乳糖可代替IPTG诱导1Dx5-N蛋白表达。     

Alcalase酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的研究

血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽在人体血压调节方面有着重要的作用,它常被用于治疗高血压及其他相关疾病,降低患者的发病率及死亡率.本文通过单因素试验研究了温度、pH、酶添加量、底物浓度以及反应时间对Alcalase酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的水解度及ACE抑制率的影响,结果表明各因素的最适条件为:温度55℃、pH 7.0、酶添加量E/S为5%、底物浓度为10%、水解时间为120min,ACE抑制率和水解度分别为89.09%及18.91%.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

蛋清源ACE抑制肽结构鉴定及其稳定性

利用碱性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽,采用交联葡聚糖凝胶色谱初步纯化具有血管紧张素转化酶抑制活性的组分,高活性组分通过液相色谱-四极杆线性离子阱串联质谱(LC-QTRAP)对纯化组分进行结构鉴定得到19个活性肽。分别对其中3个活性肽DHPFLF、HAEIN和QIGLF进行化学合成及活性测定,其中QIGLF的ACE抑制活性较高,IC50为75.00μM,对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有较强的抗酶解能力。     

大豆PM2蛋白及其结构域可提高烟草耐盐性

深圳市微生物基因工程重点实验室已利用大肠杆菌异源表达体系证明了大豆PM2蛋白（LEA3）的耐盐功能，并首次证实PM2蛋白序列中的22-氨基酸结构域（PM2B）为一主要耐盐结构域．为在高等植物中进一步验证PM2蛋白及22-氨基酸结构域的耐盐功能，将大豆PM2及PM2B基因克隆至植物表达载体pB1121，并利用农杆菌侵染法转化烟草叶盘，通过PCR扩增法鉴定转基因植株．结果表明PM2及PM2B基因已整合至转基因烟草的基因组DNA中，转化率分别为44．4％和62．5％．与含1．5％（质量分数）NaCl的培养基比较，转基因烟草植株的生长状况和叶片的叶绿素含量，结果表明转PM2和PM2B基因的烟草耐盐性明显高于对照（转化pB1121载体）植株．这说明转PM2和PM2B基因可提高烟草的耐盐能力．可见，PM2蛋白及22-氨基酸结构域在原核和真核细胞中的耐盐保护作用可能是相似的．     

FGFR3胞外区在酵母中的表达

对酵母中FGFR3胞外区蛋白表达进行研究.从pCDNA3.1-myc-His-FGFR3N中酶切得到带有myc/His标签的FGFR3胞外区DNA片段,将其克隆到pYES2中;采用醋酸锂转化法,将重组质粒转入酵母INVSc1;转化子经半乳糖诱导后,提取总蛋白进行Western-blot分析.测序结果表明:pYES2-myc-His-FGFR3N载体构建成功,Western-blot分析证实重组转化子在酵母中表达了与预期分子量大小吻合的FGFR3胞外区蛋白.     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.     

重组质粒pMG36e-nisI-gfp在乳酸菌中的应用

本研究将带有nisI和咖（绿色荧光蛋白）基因的乳酸菌表达载体pMG36e-nisI-gfp转化至乳酸菌中,观察其在宿主内的稳定性．对重组菌进行了菌体形态、传代培养、质粒验证等研究,考察了该质粒的稳定性．结果显示：重组菌在不含抗生素的培养基中连续传代20代后,质粒丢失率低;菌体大小和形态基本不变;质粒经HindⅢ酶切后大小不变;GFP在第0、5、10、15和20代宿主菌中都可以表达,表达量没有明显差别,在SDS-PAGE中的带型一致;初步的动物实验验证了该质粒作为遗传标记的应用效果．说明该质粒在宿主菌中具有良好的稳定性．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.     

芦丁鼠李糖苷酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

芦丁鼠李糖苷酶目的基因亚克隆至pPIC9K表达载体,电转化至毕赤酵母GS115中,进行了基因表达研究.结果表明,该转化宿主菌在甲醇诱导培养至144 h,表达产蛋白具有芦丁鼠李糖苷酶活性,运用SDS-PAGE电泳技术确定其分子质量为53 ku,与理论值基本相符.     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.