鸭乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、特异的鸭乙型肝炎病毒(DHBV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,设计一对引物扩增DHBV基因组,将其克隆到pMD-18-T载体上,然后以该重组质粒为模板,选择DHBV S基因保守序列设计一对定量PCR引物,构建标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯在鸭体内对DHBV-DNA复制的抑制效果。结果表明:该方法能特异性检测到DHBV;相关系数为1.00,扩增效率为105%;敏感度高,最低检测限为70个拷贝。拉米夫定和阿德福韦酯对DHBV感染后鸭外周血DHBV-DNA的复制均有很好的抑制效果,但停药后会出现轻度"反跳"现象。建立的DHBV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,可用于抗HBV药物的评价。     

实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR逐步成为转基因检测的重要工具。     

梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用

本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR检测进行对比。结果表明,实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高,能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。     

实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病田间试验药剂防治效果

[目的]评价柑橘黄龙病田间试验药剂橘叶青的防控效果。[方法]采用实时荧光定量PCR检测喷施橘叶青后的柑橘叶片和果皮中黄龙病病原菌的含量。[结果]喷施橘叶青后的叶片和果皮组织含菌量明显降低,叶片组织含菌量降低了近35倍,果皮组织含菌量降低了约7倍。[结论]防治药剂橘叶青对柑橘黄龙病具有较好的防控效果,可以有效控制病原菌在柑橘组织中发展。     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。     

柑橘黄龙病实时荧光PCR鉴定技术研究

[目的]建立一套高效、准确的柑橘黄龙病（HLB）早期鉴定手段。[方法]根据HLBsecE基因（EF164805.1）保守区域设计引物和探针,建立HLB的TaqMan探针实时荧光PCR鉴定技术。[结果]被检测的236个柑橘苗圃样品中,有54个苗圃感染了HLB,检出率为22.9%。引物特异性好。[结论]该检测方法具有快速、灵敏、重复性好等优点,其检测灵敏度达0.01 ng。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgM mRNA方法的建立

建立了SYBR greenⅡ实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgMmRNA水平的方法,即构建鲫鱼IgM标准品质粒,10倍稀释质粒标准品,建立标准曲线,进行熔解曲线分析和稳定性分析。结果表明,Ct值线性范围为5.8～25.4,相关系数为1;熔解曲线峰值单一,Tm为85.62(±0.13)℃;组内变异系数CV为0.18%～1.07%,组间变异系数为0.31%～2.31%。该方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。     

用荧光定量RT-PCR方法分析B型和ZHJ-1型烟粉虱热休克基因hsp70和hsp90的表达

【目的】比较温度胁迫对两种生物型烟粉虱体内hsps诱导表达的差异。【方法】根据烟粉虱hsp70基因、hsp90基因和18S rRNA序列,设计并合成引物用于实时定量RT-PCR,扩增产物连接到质粒pMD18-T载体上,重组质粒经筛选、签定和10×梯度稀释后作为模板,用于标准曲线的制作和样品检测,检测温度胁迫对B型和ZHJ-1型烟粉虱hsp70和hsp90 mRNA转录水平的诱导情况。【结果】在受到34℃、37℃、40℃和43℃的高温胁迫时,两者hsps的诱导水平无显著差异(P＞0.05);在受到4℃、7℃、10℃和13℃的低温胁迫时,B型烟粉虱体内hsps的诱导表达水平显著超过了ZHJ-1型烟粉虱(P＜0.05)。【结论】经检验所建立的荧光定量RT-PCR体系特异性好,灵敏度高,符合检测烟粉虱hsps mRNA转录水平的要求。低温胁迫下B型烟粉虱体内hsps的高表达可能是其较强的耐受低温能力的主要机制之一。     

转基因水稻深加工产品两种荧光定量方法的比较研究

根据转基因水稻中外源基因Cry1A(B)和内源基因SPS设计SYBR Green I引物、TaqMan引物和荧光探针,以内源基因SPS作为内参照,使用两种FQ-PCR方法对水稻深加工产品中转基因水稻的含量进行定量检测.建立了转基因水稻标准品Cry1A(B)和SPS之间的△Ct与样品中转基因水稻含量百分比之间的校正曲线和...     

应用PCR和测序技术诊断吉安和抚州两地区的柑橘黄龙病

柑橘黄龙病是国内植物检疫对象,明确其地理分布对控制黄龙病扩散具有重要意义.于2008年10～11月赴吉安和抚州可疑黄龙病桔园采集30份病样,其中吉安地区19份,抚州地区11份,采用PCR方法对这30份样品进行柑橘黄龙病菌检测,结果从吉安地区4个病样(遂川县1个、万安县2个、泰和县1个)和阳性对照中扩增到预期的长约700 bp的DNA片段,其他样品和阴性对照中则没有预期的DNA片段产生.选择遂川双桥1号、万安窑头1号和泰和文田4号3个分离物的PCR产物进行纯化、测序,从中各获得一段长为654 nt的序列.经同源性比较发现,这3条DNA序列不仅完全相同,而且它们与已报道的柑橘黄龙病菌亚洲种国内外所有分离物的对应序列的同源性也均为100%,但它们与已报道的柑橘黄龙病菌非洲种核苷酸序列同源性只有79.6%,结果表明上述3个柑橘黄龙病菌分离物均属于亚洲种.柑橘黄龙病菌亚洲种在吉安地区遂川、万安和泰和县存在的发现,希望能引起有关部门足够的重视.     

土霉素处理对柑橘黄龙病的防治效果及PP2基因表达的影响

【目的】评价土霉素(oxytetracycline,OTC)药剂对不同发病程度柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）的防治效果,并检测OTC处理后韧皮部关键基因——韧皮部蛋白2（PP2）的表达量变化,为HLB的有效防控提供科学依据,也为OTC作用机理研究提供参考。【方法】应用可有效抑制、杀死病原菌的OTC,树干定量注射0.1 g/树于不同发病程度HLB（初感染、轻度发病和重度发病3组）的4年生Valencia夏橙,注射后7、30、60、90 d定期采集Valencia叶片样品监测HLB致病菌Cadidatus Liberibacter asiaticus(Las)含量、淀粉含量及PP2基因表达量变化。树干注射OTC后90 d采集不同处理Valencia的嫩叶、成熟叶片及茎,进行淀粉染色光学显微观察（LM）,直观反映植株累积淀粉的变化。树干注射OTC后80 d调查柑橘嫩叶抽发的情况,综合一系列指标评价OTC对HLB的防治效果。【结果】注射OTC 0.1 g/树对初感染HLB的4年生Valencia植株治疗作用最明显,7 d后检测即为阴性,并可保持90 d,其成熟叶片的淀粉含量明显减少,但茎内仍有淀粉粒富集;轻度发病夏橙注射90 d后叶片内的Las含量从（1.68×10 ⁶±858884）cells/g叶片减至（7.21×10 ⁴±30981）cells/g叶片,下降幅度极为明显,其成熟叶片内的淀粉含量在90 d内一直呈下降趋势;重度发病植株注射后叶片内的Las含量从（4.10×10 ⁸±3.04×10 ⁸）cells/g叶片减至（2.80×10 ⁷±2.70×10 ⁷）cells/g叶片,但从数量而言仍然有较多分布,除了新长出的秋梢,其成熟叶及茎内的淀粉粒含量仍旧很大,说明0.1 g/株OTC不足以治愈4年生重度发病Valencia夏橙。对PP2基因表达分析结果显示,注射OTC后30 d,Valencia夏橙体内的PP2基因表达量大幅度下降,随后90 d内表达量稳定,与注射后30 d的表达量较为一致。 【结论】OTC可以用于HLB的防控,对初感染（Las含量为<9.00×10 ⁵cells/g叶片）及轻度发病（Las含量为9.00×10 ⁵—9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的柑橘植株治疗作用较好,不适用于重度发病植株（Las含量为>9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的治疗。注射OTC后,PP2基因表达量下降明显,说明OTC可有效减少韧皮部病菌等的胁迫压力。     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和La...