多重耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵基因abeM的测定及耐药性分析

目的了解临床分离株鲍曼不动杆菌对16种抗菌药物的耐药性,为抗耐药菌药物选择提供依据,并扩增外排泵蛋白编码基因abeM,以探讨鲍曼不动杆菌多重耐药与主动外排作用的关系。方法采用纸片扩散法(Kirby-Bauer)对收集的65株不重复鲍曼不动杆菌进行药物敏感性试验。应用聚合酶链反应测定多重耐药鲍曼不动杆菌主动外排系统abeM基因,并进行序列分析。结果收集的鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦敏感,耐药率15.38%,对亚胺培南耐药率为52.31%,对其余抗菌药物的耐药率在60.00%~73.85%之间;经PCR扩增,65株鲍曼不动杆菌中adeB基因阳性60株(92.31%),序列分析显示与Genbank登录的鲍曼不动杆菌ATCC 19606药物外排蛋白编码基因abeM(AB204810)的同源性为98.00%。结论 abeM主动外排作用可能是多重耐药鲍曼不动杆菌多重耐药的重要机制之一。     

鲍曼不动杆菌多重耐药及其播散机制的研究进展

近20年来,鲍曼不动杆菌已经成为医院感染中重要的病原菌[1].由于鲍曼不动杆菌具有快速获得对多种抗菌药物耐药的能力,多重耐药、泛耐药的鲍曼不动杆菌分离株不断在医院中出现,已成为威胁公众健康的重要问题,而对其多重耐药及播散机制的研究也日趋深入[2].鲍曼不动杆菌的固有耐药途径包括:酶的降解作用,靶位修饰或保护,降低对抗菌药物的通透或增加对抗菌药物的主动泵出;获得性耐药的途径为携带耐药决定簇的遗传元件的水平传播,或是由于结构基因的突变导致细菌细胞功能失活或修饰改变.其中多重耐药性的形成主要通过:携带多种耐药基因的可移动元件的水平传播;染色体基因编码的外排泵系统的高表达[3].外排泵也可以在质粒、整合子等遗传元件上存在,即可移动的遗传元件可以携带多种耐药基因(包括外排泵编码基因),使多重耐药性快速传递.现将鲍曼不动杆菌多重耐药及播散机制研究进展情况综述如下.     

48株鲍曼不动杆菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测

目的了解鲍曼不动杆菌氨基糖苷类抗生素耐药基因分布情况。方法收集蚌埠医学院第一附属医院2015年1月至12月临床分离的48株泛耐药鲍曼不动杆菌,VITEK 2Compact进行鉴定和药敏实验。PCR法检测12个氨基糖苷类修饰酶基因和3个甲基化酶基因以及外排泵基因adeB。结果在实验的16个基因中,共检出4种氨基糖苷类抗生素耐药基因aac(6′)-Ib、armA、adeB和ant(3″)-Ia,其中aac(6′)-Ib检出率为39.6%(19/48),armA基因检出率为89.6%(43/48),adeB检出率89.6%(43/48),ant(3″)-Ia检出率为10.4%(5/48),其余基因均未检出;存在两种以上耐药基因的共39株,检出率为81.3%(38/48)。结论 aac(6′)-Ib、armA基因以及外排泵adeB是介导我院鲍曼不动杆菌氨基糖苷类抗生素耐药的主要基因。     

ICU住院患者多药耐药菌感染病原特征分析

目的探究ICU住院患者多药耐药菌感染病原特征,为患者临床治疗及耐药性发展控制提供指导。方法收集ICU住院患者临床资料,采用全自动细菌鉴定仪鉴定患者感染病原菌类型。培养多药耐药鲍曼不动杆菌,采用PCR扩增检测菌株的外排泵基因。结果 1 608例监测患者中,感染数为173例,感染率为10.76%。ICU住院患者主要分布在RICU、综合ICU、SICU、神经ICU、PICU、EICU、NICU、CCU,感染率分别为23.03%、17.79%、15.77%、12.30%、6.01%、4.27%、1.90%和1.87%。多药耐药菌在患者的呼吸道、泌尿道、胃肠道、血液、皮肤软组织类、表浅切口、血管相关部位的感染率分别为34.02%、12.79%、3.38%、2.26%、1.92%、0.98%和0.97%。多药耐药菌在患者的痰液、血液、体液、脓液、尿液、其他标本的感染率分别为32.90%、3.74%、3.40%、2.69%、2.84%和7.83%。173例感染患者种共检出多药耐药菌180株。多药耐药菌类型为鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、及其他菌株,构成比分别为46.67%、13.33%、7.22%、17.78%、11.67%和3.33%。外排泵基因类型为adeA+adeB、adeB+adeC、adeA+adeB+adeC、mdfA+adeB+adeC、qacE△1+adeA+adeC、mdfA+qacE△1+adeB+adeC的多药耐药鲍曼不动杆菌检出率分别为2.38%、4.76%、44.05%、26.19%、13.10%和9.52%。结论多药耐药菌感染的ICU住院患者主要分布于呼吸重症监护病房,主要检出部位为呼吸道,痰液是主要标本来源,多药耐药鲍曼不动杆菌是主要病原菌类型。多药耐药鲍曼不动杆菌中外排泵基因分布广泛,可能导致多药耐药性发生,临床应给予重视。     

单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌耐药机制研究

目的探讨单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌中耐药相关基因突变及外排泵基因风坦两种不同耐药机制的作用。方法从国家结核病参比实验室2007年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐氧氟沙星的菌株17株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因删似和gyrB突变情况。提取gyrA和gyrB无突变菌株的RNA后反转录并采用Real—timePCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量，对比菌株最低抑菌浓度（MIC）试验结果，筛选可能与氧氟沙星药物外排泵的相关基因，并选用大肠埃希菌为模式生物构建表达载体，检测过表达目的外排泵蛋白的大肠埃希菌对氧氟沙星的耐药程度加以验证。结果在17株单耐氧氟沙星的菌株中，有4株（4／17）检测到gyrA突变，其中包括90位点突变1株及94位点突变3株，上述突变均表现为高浓度耐药，其MIC均不低于4μg/ml。在gyrA和gyrB未突变菌株中，通过real-timePCR检测发现在高浓度耐药的2株菌株中，Rv0933和Rv2938的转录水平显著高于其他低浓度耐药菌株，较对照株H37Rv转录水平高16倍和5倍。在对照组和转入pEASY-E1-Rv2938的大肠埃希菌中MIC均小于0．125μg／ml，而转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌的MIC为2μg／ml。结论本研究结果显示，gyrA耐药决定区基因突变与氧氟沙星高浓度耐药相关，PstB可能是氧氟沙星特异性的药物外排泵基因，其高水平表达与氧氟沙星高浓度耐药相关。     

鲍曼不动杆菌喹诺酮类耐药基因突变分析

目的调查鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药情况,并对喹诺酮类耐药基因突变进行分析。方法对中南大学湘雅附二医院2002~2008年间鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药情况进行统计。同时于2008年7~12月随机收集50株鲍曼不动杆菌,PCR扩增gyrA基因和parC基因,并对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),选取部分PCR扩增产物进行测序和分析。结果鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药率呈逐年上升的趋势。50株鲍曼不动杆菌对环丙沙星耐药率为62%,对左氧氟沙星耐药率为46%。gyrA基因及parC基因扩增分别获得305 bp和400 bp的基因产物。PCR-RFLP结果显示,对gyrA基因,耐药株100%不能被HinfⅠ酶切,敏感株53%能被HinfⅠ酶切;对parC基因,耐药株29%能被HinfⅠ酶切,敏感株有63%能被HinfⅠ酶切。分析测序结果,耐药株中的gyrA基因和parC基因存在突变,未被酶切的敏感株也存在突变,使HinfⅠ的识别序列GACTC变为GACTT,酶切位点GANTC消失。被酶切耐药株中发现parC基因新的突变点,第89碱基密码子GAA中的A突变成G,被酶切敏感株的parC基因出现多个位点的同义突变。结论鲍曼不动杆菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药情况严重,呈逐年上升的趋势。鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物产生耐药与gyrA基因突变和parC基因突变有关。     

耐药基因和药物外排泵在广泛耐药结核分枝杆菌中的作用初探

目的 初步探讨2种主要的耐药机制在广泛耐药(XDR)MTB临床分离株中的作用.方法 提取XDR-MTB临床分离株基因组DNA,采用PCR法扩增耐药相关基因,测序后分析其突变位点.根据XDR-MTB分离株KZN605的15个特有单核苷酸突变位点设计引物扩增后测序比对.检测药物外排泵抑制剂利血平、羰基氰化氯苯腙和盐酸维拉帕米对XDR-MTB分离株最低抑菌浓度(MIC)值的影响.结果 10株XDR-MTB菌株在rpoB、katG和rpsL位点均检测到突变,9株分离株在gyrA位点检测到突变,2株在gyrB位点检测到突变,6株分离株在rrs位点检测到突变,未检测到tlyA位点突变;未检测到大部分KZN605株特异的单核苷酸突变位点;药物外排泵抑制剂利血平导致1株XDR-MTB分离株的氧氟沙星MIC值降至原MIC的1/16,其余MIC值均无明显变化.结论 耐药相关基因突变是XDR-MTB分离株耐药的主要机制,药物外排泵可能部分参与氟喹诺酮类药物的耐药机制.     

骨科患者术后创面感染鲍曼不动杆菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性分析

目的了解医院骨科患者手术后创面感染的鲍曼不动杆菌的耐药情况,以指导医生合理用药,有效控制鲍曼不动杆菌耐药性的进一步发展,预防和减少医院感染的发生。方法从骨科患者手术后创面感染标本分离鲍曼不动杆菌28株,作gyrA基因测序,并进行BLASTn比对;通过测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行药敏试验,测定鲍曼不动杆菌的耐药性;选取经纯培养的鲍曼不动杆菌菌落置入含蛋白酶K溶液的离心管内,分别进行水浴,再离心,留取上清液,以此为模板PCR扩增与喹诺酮类抗菌药物耐药性相关的gyrA、qepA、qnrS、qnrA、qnrB和aac(6)-Ib基因,使用Chromas分析软件进行测序。结果鲍曼不动杆菌对诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星的耐药率分别为:96.43%、96.43%、96.43%、89.29%、85.71%、85.71%、82.14%、78.57%和78.57%。PCR检测28株鲍曼不动杆菌gyrA基因100%阳性,即都发生了gyrA基因突变,而其他相关基因检测均阴性。基因测序看出,其83位发生突变,即由TCA转变为TTA。结论本组分离骨科患者手术创面感染的鲍曼不动杆菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况严重,其中对诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星等的耐药率均在90%以上。临床抗感染治疗应根据耐药结果进行用药,并控制喹诺酮类抗菌药物的使用。     

鲍曼不动杆菌临床株中可移动遗传元件ISCR1的作用

目的了解鲍曼不动杆菌临床株中新型可移动遗传元件ISCR1的携带情况及其下游基因环境,探讨鲍曼不动杆菌耐药播散机理。方法收集多重耐药鲍曼不动杆菌临床株34株和敏感株21株,PCR扩增ISCR1基因及其下游的基因环境,扩增产物测序分析。结果 34株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株中,携带ISCR1基因14株,其中11株ISCR1阳性多重耐药株,在ISCR1基因下游携带氨基糖甙类耐药基因armA基因;21株敏感株中,ISCR1基因扩增结果均为阴性。结论 ISCR1元件可能参与了armA耐药基因的水平播散。     

60株鲍曼不动杆菌喹诺酮类耐药基因分析

目的探究鲍曼不动杆菌喹诺酮类耐药的机制。方法收集2009年1-12月天津市三所三甲医院各类标本分离的鲍曼不动杆菌60株。采用聚合酶链反应（PCR）扩增技术对质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、acc（6’）．Ib．cr、qepA及染色体基因gyrA和parC进行基因检测,并对阳性结果进行酶切和测序鉴定。结果60株鲍曼不动杆菌中qnrA、qnrB、qmS和qepA基因均为阴性,acc（6’）-Ib基因12株阳性,经测序证实均未出现变异。37株环丙沙星耐药的鲍曼不动杆菌中30株（81．0％）gyrA基因不被HinfI酶切,26株（70％）parc基因不被Hinf I酶切,证实有基因突变存在。结论天津地区尚未发现鲍曼不动杆菌中存在质粒介导的喹诺酮耐药机制,gyrA和parC基因变异仍为鲍曼不动杆菌喹诺酮耐药的主要原因,但同时亦有其他喹诺酮耐药机制的存在。     

深圳地区男男同性恋人群中HIV-1感染者耐药基因变异研究

目的调查分析深圳地区未接受抗病毒治疗的男男同性恋人群中,人免疫缺陷病毒（HIV）感染者的耐药突变流行情况,以进一步指导抗病毒药物的选择。方法收集2007—2008年,从未接受抗病毒治疗的男男同性恋人群中HIV—1感染者的血浆,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和套式聚合酶链反应（Nested—PCR）方法,扩增蛋白酶（PR）1基因区和反转录酶（RT）基因区,并对扩增片断进行序列测定和分析,并用Mega等软件构建进化树及亚型分析。结果共获得94份HIV-1分离株的完整的PR和RT基因序列,发生耐药突变位点的35份（37．2％）样本序列检出42个耐药性突变位点,其中1份样本产生了核苷类抑制剂（NRTI）、非核苷类抑制剂（NNRTI）耐药性突变,以及蛋白酶抑制剂（PI）主要耐药突变和P1次要耐药突变;5份样本产生了NRTI耐药性突变,20份样本产生了NNRTI耐药性突变,9份样本产生了P1次要耐药突变。非核苷类耐药性突变、核苷类耐药性突变和P1次要耐药突变位点分别以V179E、V118I和A71V为主,分别占65．0％（13／20）、66．7％（4／6）和55．6％（5／9）。结论深圳地区男男同性恋人群中的、未经抗病毒治疗的HIV1感染者中,存在原发性耐药相关基因突变位点变异,耐药基因变异处于较低水平的流行状态。     

利奈唑胺体外诱导粪肠球菌耐药株23S rRNA V区基因突变位点分析

目的阐明体外诱导利奈唑胺耐药粪肠球菌的核糖体23SrRNA V区基因位点变异特征。方法收集1株血流感染的粪肠球菌和1株粪肠球菌质控菌ATCC29212（编号分别为F3和F4菌株,均为利奈唑胺敏感株）,通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增23SrRNA V区基因,扩增产物经测序后与野生株比较,获得V区的突变位点。结果经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值粪肠球菌共13株。PCR测序分析2株母株均无变异位点,23SrRNA V区的突变位点主要是G2576U,此外还有T2504A、G2505A、C2610A、C2424U。结论体外多步法可诱导粪肠球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与23SrRNA V区位点突变密切相关,突变位点随着MIC值的增高而增多。     

羊种布氏菌体外药物敏感性分析

目的了解羊种布氏菌对常用抗生索的耐药情况及耐药机制。方法用微量稀释法对国内分离的69株羊种布氏菌进行12种抗生素（阿奇霉素、克拉霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、多西环素、利福平、头孢曲松、复方新诺明、链霉素）的耐药检测。结果除了阿奇霉素和克拉霉素外,所有羊种布氏菌对另外10种抗生素均敏感。所有菌株23SrRNA都具有单核苷酸多态性2632 T/C。结论 23SrRNA转肽酶中心点突变是羊种布氏菌耐大环内酯类耐药的机制之一。尽管布氏菌耐药尚未对布病防控构成威胁,但还需开展耐利福平监测工作。     

临沧市2012年高效抗反转录病毒治疗失败的AIDS患者耐药基因变异分析

目的：了解临沧市2012年经高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy, HAART）失败的AIDS患者耐药基因的变异情况。方法调查HAART失败AIDS患者的流行病学特征,检测CD4＋T淋巴细胞计数和病毒载量,对HIV RNA＞1×10^3 copies/ml的患者行HIV-1耐药基因检测。结果66例中有53例检出基因耐药突变。最常见的核苷类反转录酶抑制剂耐药突变位点为M184V、D67N和K70R,非核苷类反转录酶抑制剂耐药突变位点为K103N、G190A和V179D。仅发现3个蛋白酶抑制剂突变位点,分别为D33F、M46I和L76V。结论临沧市AIDS患者出现较多反转录酶抑制剂突变位点是一线抗反转录病毒治疗失败的主要原因。在选择二线治疗方案时,增加蛋白酶抑制剂可避免多重耐药导致的治疗失败。     

慢性乙型肝炎阿德福韦酯治疗应答不佳者外周血单个核细胞HBV-P区基因突变分析

目的研究阿德福韦酯（ADV）治疗基因C型慢性乙型肝炎（cHB）患者外周血单个核细胞（PBMcs）乙肝病毒聚合酶区（HBV—P区）序列的基因突变。方法14例基因c型CHB患者分为初治组（ADV初始治疗）7例,经治组（拉米夫定100mg口服每日1次,治疗24～56个月出现YMDD变异后换用ADV治疗）7例,ADV用药时间2～59个月,剂量10mg口服每日1次,血清HBVDNA≥1000copies／ml（应答不佳）者应用直接测序法检测血清及PBMCs内的HBV-P区基因突变,比较两者的异同。结果所有患者的血清和PBMCs内HBV均成功测序,大部分患者血清和PBMCs内的HBV序列一致。1例经治者和3例初治者感染的HBV为野生株,分别有11691＋＋＋V＋、Q215H＋＋＋Q＋、P237T＋＋＋突变。另10例（71．4％）检测到HBV有1个或多个耐药位点变异,主要变异位点为A181V／T／I、N236T。有1例血清HBV基因突变（A181T＋＋＋、N236T＋＋＋）与PBMCs内的HBV基因突变（A181T＋＋＋、N236T＋＋＋、11691＋＋＋V＋）不完全一致。结论ADV治疗cHB应答不佳者大部分血清与PBMCs内的HBV-P区基因突变一致,耐药模式不同,可有一个或多个位点突变,主要变异位点为A181V／T／I、N236T。     

2009-2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒基因变异分析

目的了解2009～2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的基因变异情况。方法选取2009～2013年哨点医院分离的新甲型H1N1流感病毒，进行HA和NA核苷酸序列测定，用Bioedit和MEGA version4．0分析软件进行基因种系进化特性分析。结果无锡地区2009～2013年种型H1N1流感病毒HA基因序列的同源性为98．9％～99．5％；氨基酸序列分析显示，无锡地区分离株第203位与国内、国际代表株比较发生氨基酸替换：S→T；第83位和321位与国内代表株相同，而与国际代表株不同，分别为S→P、V→I。NA基因序列与国内、国际代表株同源性为99．2％～99．8％；第87位和349位与国内代表株相同，而与国际代表株不同，分别为R→Q、D→G。结论通过对HA和NA基因序列的比对分析，2009-2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒流行株基因序列与国内、国际代表株高度同源。表明该地区近期不会发生新甲型H1N1流感大流行。     

987例乙型肝炎患者HBV-DNA P区多位点耐药突变分析及临床意义

目的分析乙型肝炎患者HBV-DNA P区基因突变情况、用药史及其临床意义。方法采用焦磷酸测序法,对368例经核苷(酸)类似物(NAs)治疗1年以上(用药组)及619例未用抗病毒药物治疗(未用药组)的乙型肝炎患者HBV-DNA P基因区9个NAs相关耐药突变位点进行检测,回顾性分析不同NAs耐药的突变形式,分析NAs治疗前HBV逆转录酶(RT)基因自然变异的发生率。结果 368例中94例出现基因耐药变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,其次为V173L、S202G/S、T184L、I169T突变,M204V多以联合L180M突变的形式存在,其中235例服用单种NAs有48例发生变异,多位点(3个及以上耐药位点)突变5例(10.42%),133例服用多种NAs有46例发生变异,多位点突变19例(41.30%),多药使用者发生多位点变异率明显高于单药使用者(χ2=8.38,P0.05)。368例患者中多位点变异组(A组)与少于三个位点变异组(B组)的年龄、HBVDNA、ALT无明显差异。619例中51例出现基因耐药变异(8.24%)。结论 HBV感染者存在少量自然变异位点。长期应用NAs可筛选出HBV-DNA P基因区的相关耐药变异且耐药变异复杂,服用多种NAs(特别是序贯治疗)容易发生基因耐药变异且易发生多位点变异。长期应用NAs的乙型肝炎患者需定期检测基因耐药情况并及时干预,避免临床反跳的发生。     

云南省2008-2012年HIV-1耐药基因型检测情况

目的了解云南省2008—2012年艾滋病病毒Ⅰ型（HIV-1）耐药基因检测及临床应用情况。方法采用反转录套式聚合酶链反应（RT-nested—PCR）方法,检测病毒抑制失败病人血浆HIV-1耐药基因型。结果截止2012年12月31日,云南省累计治疗艾滋病（AIDS）病人38055人。2008—2012年,HIV1病毒载量（VL）检测率逐年提高（54．0％～95．2％）。HIV-1VL〈50拷贝／mL者占88．7％,VL在51～1000拷贝／mL者占3．4％,VL〉1000拷贝／mL者占7．9％。对VL〉1000拷贝／mL病人血浆进行HIV-1耐药基因突变检测,共检测3766人次,获得可用序列2586例。其中未检出耐药突变的占46．2％（1196／2586）,发生耐药突变的占53．8％（1390／2586）。以2012年末累计治疗人数为基数,计算得到抗病毒治疗（HAART）人群的耐药发生率为3．7％（1390／38055）。16个地市中除丽江和迪庆两地未发现耐药毒株外,其余各地均有不同程度的耐药发生。核苷类反转录酶抑制剂（NRTI）、非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTI）和蛋白酶抑制剂（PI）的突变率分别为63．3％、95．1％和8．5％。NRTI突变位点的前3位依次为M184V／I（52．7％）、T215Y／F（11．7％）、D67N（10．2％,）,NNRTI前3位是K103N／S（37．8％）,G190A／S／E（24．4％）,Y181C／I／V（22．0%）,PI出现最多的是L33F,其次还有M46I、V82A。结论云南省抗病毒治疗病毒学失败病人中,以NNRTI耐药最为多见,其次为NRTI,PI较少,各地、市HIV耐药发生存在一定差异。HIV耐药基因检测有助于科学抉择治疗方案,在提高HAART的效果的同时,有效地节约匮乏的药物资源,减少耐药毒株的流行传播。