同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞α1[Ⅰ]及α1[Ⅲ]型胶原mRNA表达的影响

目的 :观察同型半胱氨酸 (Hcy)对血管平滑肌细胞 (VSMCs)胶原合成的影响。方法 :采用体外培养的大鼠 VSMCs,加入不同浓度的 Hcy(0、 0 .1 0、 0 .2 5、 0 .5 0和 1 .0 0 mm ol· L- 1 )作用后 ,通过测定培养基中羟脯氨酸含量和半定量 RT- PCR法检测 Hcy对 VSMCs胶原合成及对 α1 [ ]、 α1 [ ]型胶原 m RNA表达的影响。结果 :Hcy促进 VSMCs胶原合成及 α1 [ ]型、α1 [ ]型胶原 m RNA表达 ,并呈剂量依赖效应。结论 :Hcy促进VSMCs胶原合成 ,可能是通过上调 α1 [ ]、 α1 [ ]型胶原 m RNA表达实现的。     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞α1［Ⅰ］及α1［Ⅲ］型胶原mRNA表达的影响

目的：观察同型半胱氨酸（Hcy）对血管平滑肌细胞（VSMCs）胶原合成的影响。方法：采用体外培养的大鼠VSMCs,加入不同浓度的Hcy(0、0.10、0.25、0.50和1.00 mmol•L^-1)作用后,通过测定培养基中羟脯氨酸含量和半定量RT-PCR法检测Hcy对VSMCs胶原合成及对α₁［Ⅰ］、α₁［Ⅲ］型胶原mRNA表达的影响。结果：Hcy促进VSMCs胶原合成及α₁［Ⅰ］型、α₁［Ⅲ］型胶原mRNA表达,并呈剂量依赖效应。结论：Hcy促进VSMCs胶原合成,可能是通过上调α₁［Ⅰ］、α₁［Ⅲ］型胶原mRNA表达实现的。     

活化巨噬细胞培养上清液对VSMCsⅠ型胶原合成的影响

[目的]观察活化巨噬细胞培养上清液对原代培养VSMCs Ⅰ型胶原代谢的影响.[方法]体外原代培养大鼠血管平滑肌细胞并制备活化巨噬细胞培养上清液,L-3H脯氨酸掺入法和RT-PCR检测不同浓度和作用时间的巨噬细胞培养上清液对VSMCs的胶原合成和Ⅰ型胶原mRNA表达的影响.[结果]活化巨噬细胞培养上清液促进VSMCs的胶原合成,L-3H脯氨酸掺入量明显增加,呈剂量相关性,r=0.48(P＜0.05);Ⅰ型胶原mRNA表达随浓度和时间增加而上升,r值分别为0.58(P＜0.05)和0.55(P＜0.05).[结论]活化巨噬细胞分泌促进VSMCs胶原代谢,呈时间和剂量相关性,这可能是支架植入术后血管内膜过度增生的重要机制之一.     

活化Mφ培养上清液对VSMCs增殖和Ⅰ、Ⅲ胶原合成的影响

目的观察活化巨噬细胞培养上清液对原代培养VSMCs增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法体外原代培养大鼠血管平滑肌细胞并制备活化巨噬细胞培养上清液,以细胞计数和MTT染色评价不同浓度和作用时间的巨噬细胞培养上清液对VSMCs增殖的影响,L-^3H脯氨酸掺入法和反转录PCR（RT-PCR）检测Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的变化。结果活化巨噬细胞培养上清液促进VSMCs增殖,细胞计数和MTT染色结果随作用浓度和作用时间渐增;L-3H脯氯酸掺入和RT-PCR示胶原合成和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达随浓度和时间的增加而上升。结论活化巨噬细胞分泌促进VSMCs增殖和胶原代谢,此作用呈时间和剂量依赖性。     

Geminin基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)Geminin基因的表达观测VSMCs增殖情况及表型标志物。方法分别利用RT-PCR,Western blot检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化,筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型。应用[3H]-TdR、EdU掺入试验检测VSMCs增殖的情况;同时使用Western blot分别检测干扰前后相关标志性基因的表达。结果①siRNA转染后,以第1亚组干扰效果最为显著,与另外2个阳性亚组及对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。②[3H]-TdR、EdU掺入实验显示:阳性干扰组的掺入量较两对照组明显升高(P<0.05)。③siRNA转染使Geminin基因表达减弱后,阳性组VSMCs合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平显著升高,收缩型标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-Actin)表达水平明显降低,与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RNA干扰介导的Geminin基因沉寂可显著增强VSMCs的增殖能力,并有助于VSMCs的表型由收缩型向合成型转化。     

Effect of RNA interference targeting geminin on proliferation of vascular smooth muscle cells in rats

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) Geminin基因的表达观测VSMCs增殖情况及表型标志物.方法 分别利用RT-PCR,Western blot检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化,筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型.应用[3H] -TdR、EdU掺入试验检测VSMCs增殖的情况;同时使用Western blot分别检测干扰前后相关标志性基因的表达.结果 ①siRNA转染后,以第1亚组干扰效果最为显著,与另外2个阳性亚组及对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).②[3H] -TdR、EdU掺入实验显示:阳性干扰组的掺入量较两对照组明显升高(P＜0.05).③siRNA转染使Geminin基因表达减弱后,阳性组VSMCs合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平显著升高,收缩型标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-Actin)表达水平明显降低,与对照组间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 RNA干扰介导的Geminin基因沉寂可显著增强VSMCs的增殖能力,并有助于VSMCs的表型由收缩型向合成型转化.     

丹参素对肝星状细胞ERK1/2信号转导通路的影响

目的:观察丹参素对血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)刺激大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖、Ⅰ型胶原合成、磷酸化细胞外信号调节激酶1,2(Phosphoryhted extracellular signal-regulated kinase 1/2,P-ERK1/2)表达的影响,探讨丹参素抗肝纤维化的分子机制.方法:四甲基偶氮唑盐法检测大鼠HSC增殖活性;免疫细胞化学染色法测定大鼠HSC Ⅰ型胶原合成的表达;Western blot测定大鼠肝星状细胞P-ERK1/2的表达.结果:丹参素有抑制PDGF-BB刺激大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原表达,p-ERK1/2表达的作用.结论:丹参素可抑制PDGF-BB刺激的大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原合成,其机制可能与抑制ERK1/2信号转导通路有关.     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞CTCF表达的影响

目的以动脉粥样硬化(AS)的独立危险因子同型半胱氨酸(Hcy)处理人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs),观察Hcy对VSMCs多价核因子CTCF表达的影响,探讨Hcy致AS发病的可能机制。方法 将培养的VSMCs分为0、50、100、200、500及1000 mol/L Hcy处理组,以0 mol/L Hcy组为空白对照。在VSMCs覆盖瓶底70%时,将不同浓度的Hcy加入培养液,继续培养VSMCs 48 h,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组织化学方法分别检测VSMCsCTCF的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,Hcy刺激48h后,VSMCs CTCF的mRNA和蛋白表达皆明显增加,以高浓度组为著(500、1000 mol/LHcy,<0.05)。CTCF免疫组织化学阳性染色以细胞核为主。结论 Hcy升高可诱导VSMCs CTCF的表达上调。     

同型半胱氨酸对大鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的： 验证同型半胱氨酸（Hcy）是否具有促进大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）去分化的作用。 方法： SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4～7代细胞用于实验。VSMCs分为对照组、100 μmol/L Hcy干预组、500 μmol/L Hcy干预组、1 000 μmol/L Hcy干预组共4组。MTT法测各组VSMCs的增殖情况;划痕法和Transwell法检测各组VSMCs的迁移情况;ICC法检测各组VSMCs的细胞形态;Western blot法检测各组VSMCs中SM-actin、SM-MHC、Calponin、骨桥蛋白（OPN）的表达情况。 结果： 相比于对照组,Hcy组VSMCs增殖迁移增加;细胞形态变圆;SM-MCH和Calponin表达减少（ P＜0.01〉;OPN表达增加（ P＜0.01）,Hcy的这一作用与浓度呈正相关。 结论：Hcy可以促进VSMCs去分化,这可能是其促进VSMCs增殖和迁移的机制之一。     

黄连素抗心脏纤维化作用及其机制

目的 观察黄连素对心脏纤维化的影响,探讨其可能机制.方法 体外使用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激心脏成纤维细胞,建立心脏纤维化细胞模型.采用不同浓度(10~90μmol/L)黄连素刺激,观察心脏成纤维细胞的活力、胶原Ⅲ和p38 MAPK蛋白表达水平.结果 低浓度的TGF-β1可增加心脏成纤维细胞的活力,促进胶原Ⅲ的合成.黄连素呈浓度依赖性地抑制心脏成纤维细胞的活力,降低胶原Ⅲ的合成,促进p38 MAPK蛋白磷酸化.结论 黄连素可抑制心脏成纤维细胞的增殖和胶原Ⅲ的合成,其机制可能是通过磷酸化p38 MAPK蛋白起作用.     

TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的抑制作用

为探讨 TGFβ1 反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotides,ASON)对大鼠肝脏星状细胞活化及其胶原生成的作用 ,作者合成了特异性的 TGFβ1 硫代磷酸 ASON及其对照 (正义 ,错义寡核苷酸 ) ,并将其加入至培养的肝脏星状细胞中。通过细胞免疫化学方法分析 α- SMA的表达来观察肝脏星状细胞的活化 ,肝脏星状细胞产生TGFβ的水平用生物学方法测定 ,以 3H-脯氨酸掺入抑制率的测定观察胶原生成的变化。结果 :针对 TGFβ1 m RNA转译起始区的 ASON在终浓度为 1 0 μm ol/ L 时 ,能明显地抑制体外培养的肝脏星状细胞的激活、TGFβ1 的产生及其胶原的生成能力 ,而对照组寡核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。上述结果表明 ,ASON对肝脏星状细胞无损伤作用。 TGFβ1 ASON可能成为一种潜在的抗肝纤维化治疗的药物。     

外源性IL-10对大鼠肝星形细胞生物学活性的影响

目的　用白细胞介素 - 1 0 (IL- 1 0 )干预在体外培养激活的以及用血小板衍生生长因子 (PDGF)进一步激活的肝星形细胞 (HSC)模型 ,观察 HSC增殖、凋亡、收缩及胶原与纤维化相关细胞因子的表达等生物学活性 ,了解 IL- 1 0对大鼠HSC生物学活性的影响 ,探讨 PDGF对 HSC的作用机制。　方法　体外培养大鼠肝星形细胞系 ,分别用 IL- 1 0、PDGF干预以及二者共干预 ,显微镜下观察细胞收缩情况 ;采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法观察干预前后细胞增殖状况的改变 ,用半定量 RT- PCR方法检测各组 、 型胶原、转化生长因子 - β1 (TGF- β1 )、表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)及 Fas/ Fas L m RNA表达情况 ;用免疫细胞化学方法检测 IL- 1 0、PDGF干预 型胶原蛋白表达的影响。　结果　 PDGF显著增强 HSC收缩与增殖 ,促进 、 型胶原及 TGF-β1 、FGF的表达 ;IL - 1 0显著增强 HSC表达 Fas L ,并可在一定程度上抑制 HSC的增殖以及对 TGF-β1 、FGF的表达 ;IL - 1 0可显著抑制 PDGF的促收缩、增殖及促 、 型胶原、TGF-β1 表达等作用。　结论　 IL - 1 0对 HSC的增殖、收缩以及表达 、 型胶原、TGF-β1 、FGF等多方面生物学活性有一定的抑制作用。抗肝纤维化机制可能通过 Fas/ Fas L途径诱导 HSC凋亡     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响及叶酸的拮抗作用

目的探讨不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和细胞周期分布的影响及叶酸对Hcy的拮抗作用。方法正常人脐动脉VSMCs体外培养,随机分为6组:空白对照组、不同浓度Hcy干预组(50、100、2005、00μmol.L-1)和叶酸治疗组(Hcy100μmol.L-1+叶酸30μmol.L-1)。应用MTT法及流式细胞仪检测各组VSMCs增殖率及细胞周期。结果随着Hcy浓度的增加VSMCs的增殖率增加;Hcy作用后VSMCs G0/G1期细胞数降低;S期和G2/M期细胞数增加,处于DNA合成期的细胞数明显增加,而叶酸治疗组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),叶酸治疗组与Hcy 100μmol.L-1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Hcy可通过对细胞周期的影响促进VSMCs的增殖,并在一定时间和浓度范围内呈明显的剂量依赖关系;叶酸对Hcy有拮抗作用。     

同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响机制

目的旨在了解同型半胱氨酸(Hcy)的浓度对Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ型胶原的产生以及大鼠VSMCs增殖效应的影响。方法采用组织块贴壁法原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,用不同浓度的Hcy刺激大鼠血管平滑肌细胞,在不同的时间点以四甲基偶氮唑盐法检测平滑肌细胞的活性细胞数量及细胞增殖情况。以5溴-2脱氧尿苷(BrdU)法检测Hcy对大鼠血管平滑肌细胞DNA的合成作用。流式细胞仪观察细胞周期的变化,酶联免疫吸附试验测定胶原含量。结果在0．025-0．05 mmol／L的Hcy刺激下,12-48 h VSMC增殖增加明显。24-48 h,在浓度为0．025-0．05 mmol／L的Hcy刺激下细胞合成DNA明显增加,其促增殖作用明显增强(P<0．05);随着浓度的增加,大鼠血管平滑肌细胞合成DNA开始下降,至5 mmol／L浓度时最低。24 h时在浓度为0．025-0．05 mmol／L的Hcy刺激下增殖的细胞S期的百分含量较对照组和Hcy其他浓度组明显增加(P值均<0．05)。细胞的Ⅰ型和Ⅳ型胶原分泌随着Hcy浓度的升高呈现剂量依赖性增高,Ⅲ型胶原有轻度的升高,但差异无统计学意义(P>0．05),高浓度的Hcy会减少Ⅵ型胶原的分泌,并呈剂量依赖性。结论较低浓度的Hcy刺激大鼠血管平滑肌细胞的增殖加速,并可能通过改变纤维斑块中的胶原构成类型导致斑块不稳定性和易损性,最终加速粥样斑块的发生和发展。     

苯丙酸诺龙对烧伤大鼠肝脏白蛋白与创面前胶原蛋白mRNA表达的影响

目的　研究苯丙酸诺龙对烧伤大鼠肝细胞白蛋白与创面成纤维细胞前胶原蛋白 m RNA表达的影响。方法　采用随机对照设计 ,使用苯丙酸诺龙治疗 2 0 %体表面积深 度烫伤大鼠 ,分别于伤后第 4、7、14、2 1d处死 ,留取肝组织与创面肉芽组织 ,RNA一步法分别提取二者总 RNA,RT- PCR一步法扩增检测白蛋白与 α1( )前胶原蛋白 m RNA表达水平。结果　实验组肝脏白蛋白 m RNA与肉芽组织 αl( )前胶原蛋白 m RNA表达水平明显提高 ,在各时间点均明显高于同期对照组 (P<0 .0 5 ) ,伤后第 7、14 d为 m RNA快速增长时期 (P<0 .0 1)。结论　苯丙酸诺龙能有效上调肝脏白蛋白 m RNA与肉芽 α1( )前胶原蛋白 m RNA的表达水平 ,有利于蛋白合成与逆转负氮平衡 ,从整体与局部促进创面愈合。     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORCl基因表达抑制后对VSMCs表型的影响.方法 实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性siRNA组.应用Western blot检测ORC1基因表达的变化;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构;应用流式细胞仪检测细胞表型标志蛋白表达.结果 ①siRNA转染后,阳性siRNA组ORCI基因表达水显著降低,而正常对照组及阴性siRNA组间ORC1基因表达水平无显著差异.②siRNA转染后,阳性转染组细胞呈现收缩型形态特征,空白对照组及阴性对照组细胞呈现合成型形态特征.③siRNA转染使ORCI表达减弱后,VSMCs收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)和平滑肌肌动蛋白重链2(SM-2)表达水平明显升高.合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin)表达水平明显降低,空白对照组及阴性对照组间3种标志物表达水平无显著差异.结论 RNA干扰介导的ORC1基凶沉寂可促使VSMCs由合成型向收缩型转化.     

同型半胱氨酸与血管内皮细胞功能的研究进展

同型半胱氨酸 (Homocysteine,Hcy)已被证实是动脉硬化 (Atherothrombosis,AS)的独立危险因素。目前已知Hcy是通过损害内皮功能 ,促进血小板激活 ,诱导平滑肌细胞增殖 ,促发脂质过氧化及增加肝细胞胆固醇合成等途径诱导AS的发生[1 ] 。通过近年来国内外关于Hcy致动脉硬化的研究提示 :Hcy影响血管内皮细胞损伤和功能失调导致动脉硬化的产生可能通过下列几点 :①Hcy可能通过氧化应激机制导致内皮细胞出现坏死、凋亡等损伤改变 ,影响内皮细胞功能导致AS发生 ;②特异性抑制谷胱甘肽过氧化物酶 ,造成血管内皮损伤 ;③Hcy与金属离子、氧自由…     

PPARα对糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞的作用

目的:观察氯贝特对糖基化终产物(AGEs)刺激下的离体大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用以及对过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)基因及蛋白表达水平的影响,探讨PPARα在AGEs诱导VSMCs增殖中的作用。方法:体外培养大鼠VSMCs,应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用MTT法观察不同浓度的AGEs对VSMCs增殖的影响及氯贝特与AGEs共孵育对VSMCs增殖的干预作用,并用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测PPARα的mRNA表达,Western blotting分析PPARα的蛋白表达。结果:AGEs增加DNA的合成促进平滑肌细胞的增殖,氯贝特激活PPARα,使PPARα的表达量增加,抑制AGEs诱导的细胞增殖和DNA合成。结论:AGEs诱导平滑肌细胞增殖与平滑肌细胞PPARα表达相关,PPARα表达下调可能是产生糖尿病动脉粥样硬化的重要原因之一。     

哇巴因与地高辛对大鼠肝脏钠泵A亚单位基因表达的影响

目的　观察哇巴因与地高辛对大鼠肝脏钠泵基因表达的影响 .方法　分别给大鼠注射哇巴因 (2 0 μg· kg- 1·d- 1 )、地高辛 (32 μg·kg- 1·d- 1 )和生理盐水 (1m L· kg- 1·d- 1 ) ,观察给药后 6wk大鼠血压的动态变化 ;并分别应用分子生物学 RT- PCR及免疫组织化学技术 ,探讨各组大鼠肝脏钠泵 α1 ,α2 及 α3 亚单位 m RNA及蛋白水平基因表达的改变 .结果　给予哇巴因 2 wk后大鼠血压开始升高 ,至 6 wk时明显高于生理盐水组 (17.7± 1.2 ) vs(15 .4± 1.1) k Pa,P<0 .0 1) ,而实验过程中地高辛组血压与对照组比较差异不明显 .无论是在 m RNA水平还是在蛋白水平 ,哇巴因对大鼠肝脏钠泵α1 亚单位表达无影响 ,而地高辛使α1 亚单位表达增强 ;两组大鼠 α2 亚单位表达均无改变 ;哇巴因使 α3 亚单位蛋白水平表达减弱 ,而 m RNA水平增强 ,地高辛组大鼠肝脏钠泵 α3 亚单位无论在 m RNA水平及蛋白水平表达均增强 .结论　哇巴因在高血压发病中可能起着重要作用 ;哇巴因与地高辛可导致不同的钠泵基因表达改变 ,为进一步揭示内源性哇巴因生理与病理作用以及洋地黄类药物药理与毒理作用的分子机制提供了理论及实验依据     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞周期及P27和CyclinA表达的影响

目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)对血管平滑肌细胞(VSMCs)生长周期的变化特点及P27和细胞周期素A( CyclinA)表达的影响.方法 正常人脐动脉VSMCs体外培养,随机分为空白对照组、不同浓度Hcy干预组(50、100、200、500 uM)、叶酸治疗组(Hcyl00 uM+叶酸30 uM),总计6组.以MTT检测VSMCs的增殖率,流式细胞仪测定细胞周期,RT-PCR和Western blotting测定P27和CyclinA基因mRNA及蛋白水平.结果 不同浓度Hcy干预的VSMCs与空白对照组和叶酸治疗组相比:随着Hcy浓度的增加VSMCs增殖率增加,处于S及G0/M期的VSMCs比例亦逐渐增加:RT-PCR和Western blotting显示CyclinA mRNA与蛋白表达逐渐增加,P27 mRNA与蛋白表达逐渐降低;叶酸治疗组与空白对照组比所有结果均无明显变化.结论 Hcy可通过调节P27和CyclinA mRNA水平,影响细胞周期各时相分布,从而促进VSMCs的增殖:叶酸对Hcv有拮抗作用.