芳香烃受体(Ahr)蛋白介导类风湿关节炎(RA)骨破坏机制研究的实验设计

【立论依据】 近年发现,芳香烃受体蛋白(Aryl hydrocarbon receptor, Ahr)与RA骨破坏密切相关,可能成为RA的潜在治疗靶点。 【设计思路】 Wnt信号通路是成骨分化成熟的必需信号,干扰Wnt信号通路可显著抑制成骨。我们的前期实验结果显示升高的Ahr抑制了成骨细胞的分化发育和功能。为此,我们推测Ahr的内源性配体可能会拮抗Wnt蛋白与受体的结合;或Ahr作为胞内蛋白可能会促进β-catenin磷酸化降解;以及Ahr入核后可能直接或通过抑制Wnt信号通路而间接抑制成骨的靶基因转录,最终导致RA骨破坏。 【实验内容】 本实验将通过测定关节炎小鼠Ahr活化后成骨细胞分化成熟中各期标志性分子表达量的变化,明确Ahr活化对关节炎小鼠成骨细胞分化、发育和功能的抑制作用;通过测定Ahr活化后各期成骨细胞相关转录因子表达量的变化,明确Ahr活化对关节炎小鼠各期成骨细胞转录因子的抑制作用;通过测定Ahr活化后各期成骨细胞Wnt信号通路相关分子表达量的变化,探讨Ahr抑制Wnt信号通路分子降低成骨的机制;最后通过体内实验评估Ahr对关节炎骨破坏的影响。 【材料】 胶原诱导关节炎小鼠,分离的小鼠骨髓间充质干细胞,Ahr激动剂(TCDD)和抑制剂(DIM),real-time PCR、蛋白质印迹、免疫化学染色、流式细胞术、MTT、CHIP等实验方法中需要的各种试剂及设备。 【可行性】 相关文献显示Ahr激动剂可抑制成骨细胞分化发育,拮抗Ahr可改善关节炎症状,这为深入研究提供了理论依据;我们的前期结果显示RA模型鼠关节成骨细胞高表达Ahr;Ahr表达量与骨密度负相关,原代培养关节炎小鼠成骨细胞的成熟度下降,这为本实验设计提供了数据支持。 【创新性】 本实验的设计理念是依据目前对Ahr与自身免疫病的研究进展及RA骨破坏病理改变机制的最新认识,即Ahr与RA骨破坏密切相关;本实验设计的科研假说是通过文献汇总提出的,具有一定原始创新性,即Ahr直接或干扰Wnt信号通路促进骨破坏;本实验设计如能获得预期结果,可能为RA骨破坏新机制的揭示提供实验数据,也可为同时抑制炎症和骨破坏的RA防治理念提供新靶标。     

成红细胞样Ter细胞在胶原诱导性关节炎发病中的作用

目的 通过检测Ter细胞在不同发病阶段胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠脾脏中的数量变化及高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞与关节评分和T、B细胞亚群比例的相关性,探讨Ter细胞在CIA发生和发展中的作用,从而进一步深入理解类风湿关节炎的发病机制。方法 6~8周的DBA/1小鼠进行CIA模型的诱导,二次免疫后开始对CIA小鼠进行关节评分。根据发病时间和关节评分将CIA分为发病早期、高峰期、晚期三个阶段。发病高峰期小鼠根据最终关节评分再分为高评分组(>8分)和低评分组(≤8分),流式细胞术检测na?ve小鼠和各个阶段CIA小鼠脾脏中Ter细胞比例及发病高峰期CIA小鼠脾脏T、B 细胞亚群比例,并进行关联分析。结果 发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例较na?ve小鼠明显升高(8.522%±2.645% vs. 1.937%±0.725%,P<0.01), 高评分组小鼠脾脏Ter细胞比例明显低于低评分组(6.217%±0.841% vs. 10.827%±0.917%,P<0.01)。高评分组小鼠脾脏Th1细胞比例明显高于低评分组(1.337%±0.110% vs. 0.727%±0.223%,P<0.05),高评分组小鼠脾脏Th17细胞比例高于低评分组(0.750%±0.171% vs. 0.477%±0.051%,P=0.099),高评分组小鼠脾脏生发中心B(germinal center B,GC-B)细胞比例明显高于低评分组(1.243%±0.057% vs. 1.097%±0.015%,P<0.05)。相关性分析结果显示,发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例与CD4 ⁺T、Th1、Th17、GC-B细胞比例均呈强负相关,与B10细胞比例呈强正相关,相关性均有统计学意义,提示这群细胞在CIA中可能具有保护作用。动态变化研究显示,随着疾病进展,发病晚期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例较高峰期明显降低(0.917%±0.588% vs. 8.522%±2.645%,P<0.001), 进一步提示这群细胞在关节炎中的保护作用。 结论 Ter细胞在发病高峰期CIA小鼠脾脏中明显增加,与小鼠关节评分及致病性免疫细胞比例呈负相关,与保护性免疫细胞比例呈正相关,发病晚期CIA小鼠Ter细胞比例明显降低,提示Ter细胞可能作为一种保护性细胞参与类风湿关节炎的发生和发展,但其具体作用及机制仍需后续进一步的体内及体外实验验证。     

新疆黑蜂胶调节小鼠T细胞亚群及细胞因子作用研究

【立论依据】 蜂胶调节人体免疫细胞功能,具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等功效,应用前景广阔。目前研究蜂胶在疾病中免疫激活和调节作用主要集中在其对固有免疫(如吞噬细胞)的激活作用,对蜂胶调节T细胞亚群的功能及其增强特异性免疫应答的作用机制,目前文献报道甚少,对新疆黑蜂胶免疫调节功能的研究尚无文献报道。 【设计思路】 研究新疆黑蜂胶对小鼠T细胞亚群的转化和功能影响,初步探讨其免疫调节和抗肿瘤功能的机制。 【实验内容】 (1)新疆黑蜂胶体外诱导小鼠淋巴细胞增殖实验,采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖活性,并获得初步实验结果即新疆黑蜂胶对淋巴细胞具有激活作用且存在明显的浓度依赖性。(2)研究新疆黑蜂胶对小鼠T细胞亚群的调节作用,应用流式细胞技术、CBA法或ELISA法分别检测服用不同剂量黑蜂胶粗品的小鼠Treg、Th17、CTL细胞亚群及其分泌的细胞因子(TGF-β、IL-10、IL-17、IL-2、IFN-γ),分析新疆黑蜂胶对T细胞亚群形成的免疫平衡作用以及正/负调节免疫应答的机制。(3)开展新疆黑蜂胶体外抗肿瘤实验。采用流式细胞技术等方法检测和观察黑蜂胶对小鼠肿瘤细胞凋亡,分析其对Fas凋亡受体表达的正调节作用。以上几项研究均采用高中低三个不同蜂胶剂量,同时探讨其功能与药物剂量的相关性,并筛查黑蜂胶有效作用浓度。 【材料】 新疆黑蜂胶醇提粗制品;Balb/C小鼠;MTT,检测小鼠Treg、Th17、CTL的荧光标记抗体试剂,检测小鼠CK的抗体标记CBA;流式细胞仪、酶标仪等仪器。 【可行性】 本次课题成功立项新疆医科大学2013年大学生科研项目,本课题项目团队在教师指导下提取了黑蜂胶并已完成实验内容1,为其余实验做了很好的准备,在我校内具有实验所需仪器和技术支持。 【创新性】 新疆黑蜂胶产品是珍贵的本土资源,具有很高的经济和科研价值。目前研究蜂胶的免疫功能主要集中在其对固有免疫(如吞噬细胞)的激活作用,对蜂胶调节T细胞亚群研究文献报道甚少,对新疆黑蜂胶免疫调节功能的研究尚无文献报道。     

白芍总苷抑制NLRP3活化治疗干燥综合征小鼠的实验研究

目的：探讨白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）治疗干燥综合征的效果及与抑制核苷酸结合寡聚化结构域 （nucleotide binding oligomerization domain，NOD）样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3， NLRP3）炎症体活化的关系，旨在阐明TGP治疗干燥综合征的新机制。方法：选取雌性非肥胖性糖尿病小鼠为干燥综合征模型。400 mg/kg TGP灌胃1个月后，测量小鼠唾液流量，观察颌下腺组织淋巴细胞浸润情况，检测脾脏细胞NLRP3炎症体活化状态。体外刺激脾脏细胞NLRP3炎症体活化，并用100 μg/mL TGP处理，RT-qPCR和Western blot法检测脾脏细胞NLRP3炎症体活化状态。结果：与对照组相比，TGP灌胃组小鼠唾液流量显著增加（P＜0.05），颌下腺组织淋巴细胞浸润显著减少，脾脏细胞的NLRP3炎症体表达水平显著下降（P＜0.05）；体外实验也表明，TGP抑制脾脏细胞的炎症体活化（P＜0.05）。结论：TGP改善干燥综合征小鼠症状，其机制与抑制NLRP3炎症体活化相关，揭示了TGP治疗干燥综合征的新机制，为进一步推广应用 TGP治疗干燥综合征提供了新的证据。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

基于NF-κB探究苗医验方四大血调控佐剂性关节炎大鼠TNF-α表达的作用机制

【立论依据】 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的致残率在关节病中高居首位。四大血流传于西南苗族地区,在风湿类疾病的治疗中应用广泛。研究显示,炎症因子(如:TNF-α、IL-1β等)及信号通路(如:NF-κB等)的上调及激活与RA发病密切相关,且RA临床症状的改善与炎症因子的下调及信号通路的抑制有关。因而我们提出猜想:四大血能否下调TNF-α、IL-1β表达、抑制NF-κB激活?若能下调,该作用是否与抑制NF-κB有关? 【设计思路】 首先用四大血作用于RA模型动物及关节滑膜细胞,观察其能否下调TNF-α、IL-1β表达;若能,则对另一组RA模型动物及滑膜应用NF-κB抑制剂,去除NF-κB在四大血作用RA过程中的影响;之后,应用四大血观察TNF-α、IL-1β的表达水平是否下调,若未下调,说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用只与其抑制NF-κB有关,若部分下调(与应用NF-κB抑制剂之前相比,下调幅度减少),说明四大血下调TNF-α、IL-1β与抑制NF-κB部分有关,若完全下调(下调幅度与应用NF-κB作用前相同),说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用与其抑制NF-κB无关。 【实验内容】 (1)建立RA动物模型——佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠用于体内实验,并培养AA大鼠滑膜细胞用于体外实验;(2)灌胃给予AA大鼠及滑膜细胞一定浓度四大血;(3)观察给药后TNF-α、IL-1β变化情况;(4)若TNF-α、IL-1β下调,则用NF-κB抑制剂(BMS345541)对另一组AA大鼠及滑膜细胞进行预处理;(5)预处理后的AA大鼠及滑膜细胞给予一定浓度四大血;(6)观察TNF-α、IL-1β的表达水平。 【材料】 试剂:四大血、TNF-α、IL-1β等。动物及组织:SD大鼠、滑膜细胞。仪器:酶标仪、细胞培养箱等。 【可行性】 (1)本实验组前期成功建立AA大鼠模型并通过测量大鼠足跖肿胀度及病理形态学观察,证实了四大血最RA确切的治疗作用,具有较为扎实的实验基础;(2)所需实验器材易于获取;(3)采用常规实验手段,方法稳定可靠;(4)小组成员掌握所需实验技术手段,技能可靠。 【创新性】 (1)本实验研究对象为西南民族草药,具有地域性、民族性、特色性;(2)应用信号通路抑制剂,从而在去除NF-κB的基础上,单方面的探讨四大血对TNF-a、IL-1β的作用。     

类风湿性关节炎患者外周血NKG2D、NKG2A及颗粒酶B表达的研究

目的 本研究旨在探讨类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者外周血中NK细胞表达NKG2D、NKG2A及胞内颗粒酶B的水平,并且分析它们与疾病活动度（DAS28）的相关性。方法 流式细胞术检测41例RA患者和35例健康对照者外周血中NK细胞、NKG2D⁺NK细胞、NKG2A⁺NK细胞以及颗粒酶B⁺NK的表达水平;采用Spearman秩相关分析法分析它们与DAS28的相关性。结果 RA患者外周血中,NK细胞表达水平显著低于健康对照组（P=0.016）;NKG2D的表达水平显著低于健康对照组（P=0.002）,且NKG2D的表达水平与DAS28评分呈负相关（P<0.05）;NKG2A的表达水平与健康对照组之间比较差异无统计学意义（P=0.547）,且与DAS28评分不存在显著相关性（P>0.05）;颗粒酶B的表达水平有所降低（P=0.034）,但与DAS28评分不存在显著相关性（P>0.05）。结论 活化性受体NKG2D以及胞内颗粒酶B表达的异常降低可能导致NK细胞杀伤活性的损伤,不能有效杀伤免疫效应细胞,从而促进了RA的发生、发展。     

草苁蓉环烯醚萜苷对H22小鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用

目的 探讨草苁蓉环烯醚萜苷对小鼠H²²移植瘤的生长抑制作用。方法 建立小鼠皮下H²²移植瘤模型,将实验动物分为模型组、草苁蓉环烯醚萜苷高、中、低剂量（400、200、100 mg/kg）组和5-Fu（25 mg/kg）组,草苁蓉环烯醚萜苷组连续ig给药10 d;5-Fu组隔日ip给药,给药5次,计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数,并以ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）,比色法检测血清总抗氧化活力（T-AOC）和丙二醛（MDA）水平。结果 与模型组比较,草苁蓉环烯醚萜苷能显著减轻移植瘤瘤质量,高、中、低剂量组抑瘤率分别为38.05%、34.98%、26.95%。同时,明显升高荷瘤小鼠的脾脏指数,升高血清IL-2水平和降低TNF-α水平,升高血清T-AOC和降低MDA水平。结论 草苁蓉环烯醚萜苷对H²²移植瘤具有明显的抑制作用,其作用机制可能与调节IL-2和TNF-α等细胞因子的表达以及增强荷瘤小鼠抗氧化能力有关。     

人工合成红景天苷对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤早期防治作用的机制初探

【立论依据及设计思路】 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是呼吸道重大疫病(如SARS、禽流感等)的病理基础,ALI进一步发展即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),目前尚无有效的治疗手段。民间用红景天治疗肺炎咳嗽和咳血等症状已有上千年历史,新近发现传统中药红景天对ALI具有保护作用,其主要有效成分红景天苷可能发挥主要功能,但机制不详。目前如何开发人工合成的高纯度红景天苷替代日益枯竭的红景天资源用于临床治疗是个亟待解决的问题。我们的初步研究提示,人工合成红景天苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠的ALI早期具有防治效果。在此基础上,我们将进一步探究红景天苷治疗ALI的分子机制。 【实验内容】 动物实验:LPS气管滴注构建ALI的大鼠模型,实验分组:对照组、LPS组、LPS + 地塞米松组、LPS + 不同剂量红景天苷组,观察指标:血气分析(PaCO2、PaO2、pH)、血球分析(白细胞总数、中性粒细胞数等)、肺大体和肺组织形态学(H-E染色)、肺系数和肺湿/干重比、肺泡灌洗液(总蛋白含量、中性粒细胞数、促炎因子NF-κB、IL-1和IL-6水平);细胞实验:分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,并与大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383同步进行实验,实验分组:对照组、LPS组、LPS + 不同剂量红景天苷组。细胞经相应药物处理,收集细胞和培养上清,检测关键炎症信号通路LPS/NF-κB(如NF-κB转录活性、NF-κB与DNA结合活性和NF-κB核转位等)和LPS/MAPK(如p38、ERK 和JNK磷酸化)的改变, ELISA测定培养上清中NF-κB、IL-1和IL-6等炎症介质含量。最后进行统计学分析。 【材料】 雄性SD大鼠,NR8383细胞系,纯度>99.5%的人工合成红景天苷,LPS。 【可行性】 前期预实验结果提示人工合成红景天苷对LPS诱导大鼠ALI早期具有防治作用。目前已成功分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,为在细胞分子水平探讨作用机制提供可能。 【创新性】 首次探究人工合成红景天苷对LPS诱导大鼠ALI早期的防治作用及其可能的分子机制。     

运动训练联合黄芩苷干预高脂小鼠胰岛素抵抗的实验研究

【目的】 胰岛素抵抗贯穿于2型糖尿病的全过程,是2型糖尿病的病理学基础。骨骼肌是机体最大的胰岛素靶器官,是转运葡萄糖的主要场所,胰岛素抵抗的发生与骨骼肌相关性引起我们的兴趣。本课题拟建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛素抵抗模型,用黄芩苷和运动训练进行干预,初步观察药物和运动干预对肥胖小鼠胰岛素抵抗的影响。 【方法】 将64只健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为8组,正常喂食:空白组、运动组、黄芩苷组、运动+黄芩苷组;高脂喂食:高脂空白组、高脂运动组、高脂黄芩苷组、高脂运动+黄芩苷组。用高脂饲料喂养高脂组小鼠14周,测定体重、空腹血糖和糖耐量、胰岛素耐量指标,建立高脂小鼠模型,同时以正常饲料喂养正常组小鼠14周作为对照。 随之,给予相应组别灌胃黄芩苷或者进行运动训练11周,分别测定各组小鼠体重、空腹血糖、餐后血糖和血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、肌酸激酶等含量。取骨骼肌制作切片,油红染色观察脂质沉积的情况。黄芩苷剂量为(每日200 mg/kg);运动组小鼠用YLS-10B轮转式疲劳仪进项训练,20转/min,50 min/d,5 d/周。 【结果】 与高脂空白组相比,高脂黄芩苷组小鼠的体重、空腹血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明显下降,血清高密度脂蛋白明显升高,脂质沉积减少;与高脂空白组相比,高脂运动组小鼠的血清甘油三酯和低密度脂蛋白均明显下降,体重、空腹血糖、总胆固醇都有下降趋势,脂质沉积减少。与高脂运动组相比,高脂运动+黄芩苷组小鼠的空腹血糖和总胆固醇明显下降,体重、甘油三酯、低密度脂蛋白有下降趋势,高密度脂蛋白有升高趋势,脂质沉积减少。 【结论】 黄芩苷和运动训练对高脂小鼠均具有降脂作用、对高脂小鼠的异常糖代谢均具有改善空腹血糖和餐后血糖的作用,可能与改善骨骼肌的胰岛素抵抗有关。     

结核分枝杆菌38KD蛋白对小鼠树突状细胞的功能影响

【立论依据】 结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌,属胞内寄生菌。MTB感染机体后由抗原提呈细胞(APC)将抗原分子提呈给初始T细胞,诱导体内产生以细胞免疫为主的适应性免疫应答。树突状细胞(DC)作为提呈能力最强的APC在机体抗结核免疫中起着重要作用。有研究表明MTB可通过影响DC的功能来调节淋巴细胞的应答。如Palma 等发现MTB的PstS1蛋白可刺激DC诱导记忆性T细胞增殖并分泌更多的IFN-γ 和 IL-22;Byun 等则发现Rv0315(一种新的MTB抗原)可促进DC的成熟进而诱导Th1型免疫应答。而38KD蛋白作为MTB的一种具有强免疫原性的免疫原,其对树突状细胞的影响尚不清楚。本课题通过体外诱导表达MTB-38KD蛋白,刺激小鼠DC,研究其相关分子的变化情况,以明确38KD蛋白对DC的功能影响。 【设计思路】 构建38KD载体,诱导蛋白表达纯化后体外刺激小鼠DC,在不同时间点检测DC相关分子表达情况。 【实验内容】 38KD蛋白基因从MTB提取扩增验证后,将其构建到pET28a质粒上转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达并纯化,以不同浓度38KD蛋白刺激小鼠骨髓源DC,在不同时间点用流式细胞术检测表面CD11c、B7、MHC-Ⅱ等分子表达、ELISA检测培养上清IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ分泌情况。 【材料】 昆明小鼠、MTB菌株、质粒pET28a、BL21(DE3)、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、SDS-PAGE配胶所需试剂、相关细胞因子ELISA检测试剂盒、荧光标记抗体(抗CD11c、B7、MHC-Ⅱ)等。 【可行性】 已有研究表明MTB的抗原成分与DC有关,38KD蛋白作为MTB的主要免疫原,极有可能对DC的功能有一定的影响;项目组已构建38KD蛋白原核表达载体,并参与发表相关科研文章,具有一定的结核研究基础,并可提供相关理论和技术支持。 【创新性】 本课题首次观察MTB-38KD蛋白对小鼠DC的影响,为后续抗MTB感染机制的研究提供理论基础。     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。     

阻断STAT3调控Th17/Treg平衡抑制免疫性肝损伤的实验研究

【立论依据】 肝病临床难治,关键在于免疫应答不力。肝损伤程度与免疫调控密切相关,近年来发现的Th17/Treg细胞失衡,可参与多种疾病的发生发展,但在肝损伤的研究甚少。调节Th17增殖和功能的关键是转录激活因子STAT3。研究发现,一种去乙酰酶抑制剂LBH589可以阻断STAT3,引起Th17/Treg细胞变化。 【设计思路】 本实验拟建立免疫性肝损伤模型,从细胞、蛋白、基因水平对Th17、Treg细胞数量及功能进行评估,探究Th17/Treg细胞失衡与肝损伤的相关性及机制。并采用LBH589分别从体内、体外观测免疫调控效果。 【实验内容】 Wistar大鼠随机分为两组。尾静脉注射ConA建立模型组(CC),PBS注射建立对照组(HC)。CC组自第六周始腹腔注射LBH589(乙组),甲组注射PBS至建模结束,血清学肝功能检测及肝脏病理分析确定建模成功。取外周取血检测TIMP-1、HA水平。取PBMC体外细胞培养,用不同浓度LBH589处理(G2、G3),PBS处理作为对照组(G1),ELISA检测上清液IL-17、IL-6等相关细胞因子的含量。FCM检测Th17细胞和Treg细胞频率变化,计算Th17/Treg比值;免疫组织化学法检测Foxp3、RORγt蛋白表达情况;ELISA法检测外周血IL-17、IL-6等相关细胞因子。 【材料】 健康的雄性wistar大鼠、流式细胞仪、conA(白色冻干粉)、OLYMPUS400自动生化仪,免疫组化试剂、ELISA反应试剂盒、TIMP-1单克隆抗体试剂盒、DMSO溶剂、大鼠透明质酸ELISA试剂盒、96孔培养板。 【可行性】 课题思路逻辑、合理、创新,前期预结果良好。具备该课题实施所需的人员素质和实验环境。课题指导教师多年来致力于肝病的免疫学研究,并取得一定成果。所属实验室为山东省十二五重点实验室,国家级实验与教学示范中心,具有完善的实验科研环境。 【创新性】 肝病临床难治,关键在于机制不清。本课题首次提出把各细胞亚群的网络平衡学说应用于疾病的研究,认为肝病的发展演变,关键在于Th17/Treg细胞亚群的失衡,为肝病发生发展机制提供了理论依据。并通过阻断STAT3免疫调控Th17/Treg细胞平衡状态,以期肝脏损害发生改变,从而达到抑制病情的治疗目的,为其临床治疗提供新的线索。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

Fucoidan干预小鼠肝癌淋巴道转移及其分子机制研究

【立论依据】 我国有辽阔的海域,海洋药物资源丰富,开发潜力巨大。随着陆地资源的日益枯竭,海洋药物开发研究已迫在眉睫。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是从Undaria pinnatifida孢子叶中提取富含L-岩藻糖和硫酸根的天然水溶性胞外杂聚糖,研究表明其具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂等作用。恶性肿瘤患者的死亡主要是由于肿瘤的转移造成的,其中淋巴道转移是肿瘤转移的重要方式。HGF、C-Met及VEGF-C、VEGFR-3是转移通路中重要的细胞蛋白和膜表面受体蛋白,在转移中起着极其重要的作用。 【设计路思】 本实验以探究Fucoidan对小鼠肝癌淋巴道转移的影响为目的,检测了药物处理后肿瘤细胞转移相关蛋白VEGFR-3、C-Met及细胞外分泌因子VEGFC、HGF的变化,为临床肿瘤转移药物的开发应用提供前期基础研究依据。 【实验内容】 本研究以小鼠肝癌细胞系Hca-F为细胞模型,采用蛋白质印迹法、酶联免疫吸附剂测定法、聚合酶链式反应法、Transwell法等,检测药物对Hca-F细胞的转移、侵袭相关蛋白表达以及基因转录的影响。 【材料】 大连海域自然生长的裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶、小鼠肝癌Hca-F细胞系、细胞和分子生物学实验所需试剂、抗体、Transwell小室等。 【可行性】 本课题组从裙带菜孢子叶中提取Fucoidan,对其进行纯化及理化性质分析,并对其抗肿瘤、免疫调节等活性进行研究,已完成对Hca-F细胞生长因子受体VEGFR-3和C-Met表达,以及生长因子VEGF-C和HGF的分泌进行检测。本实验设计合理,具有可行性。 【创新性】 目前对Fucoidan的研究主要集中于诱导肿瘤细胞凋亡,对其抗肿瘤侵袭转移的研究却鲜有报道。本实验以Hca-F细胞株为研究对象,探究Fucoidan对小鼠高淋巴道转移细胞Hca-F侵袭转移的影响,具有一定创新性。     

E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞中的表达研究

目的 研究E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞（RA FLs）中的表达,分析其表达与类风湿关节炎病理特征的关系,以及调控E2F2表达的机制。方法 采用瞬时转染的方法将E2F2 siRNA转染入RA FLs后,应用RT-PCR 法筛选干扰效率最高的siRNA,并应用MTS法检测干扰E2F2表达后对RA FLs增殖的影响,采用ELISA法检测E2F2下游基因表达的变化。采用RT-PCR法检测分别使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs以及共同使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs后E2F2的表达。通过染色质免疫沉淀法（ChIP）检测调控E2F2表达的方式。结果 在siE2F2后,与对照组相比E2F2在mRNA水平表达显著降低（P<0.01）,细胞增殖能力减弱（P<0.05）。在RA FLs中TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达。结论 在RA FLs中E2F2存在高表达现象,并且E2F2的高表达参与RA的病变过程,TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达,可做为治疗类风湿关节炎的新靶点。     

Gas6对类风湿关节炎小鼠Th17/Treg细胞平衡和炎症反应的调控作用

目的探讨生长停滞特异性蛋白6（Gas6）对类风湿关节炎小鼠的保护作用及与辅助性T细胞（Th）17/调节性T细胞（Treg）的关系。方法将24只雄性DBA/1J小鼠按照随机数字表法分为对照组、胶原诱导的关节炎（CIA）组、CIA+生理盐水组和CIA+Gas6组,每组6只。在小鼠尾根部皮下注射弗氏完全佐剂与牛II型胶原蛋白混合乳剂0.1ml,21d后再次以弗氏不完全佐剂与牛II型胶原蛋白混合乳剂0.1ml构建CIA小鼠模型。模型建立后第42天记录小鼠关节炎指数（AI）评分;采集下腔静脉血1ml,以酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子IL-17和IL-10的表达;无菌切取脾脏,采用流式细胞术检测CD4+IL-17+细胞和CD4+Foxp3+细胞的比例;切取右踝关节,HE染色观察关节损伤情况。结果与对照组小鼠相比,CIA小鼠AI评分增高,踝关节存在明显的炎症细胞浸润和软骨破坏,血IL-17和IL-10水平均显著增加（均P＜0.05）;CIA小鼠脾脏CD4+IL-17+细胞比例升高,而CD4+Foxp3+细胞的比例下降（均P＜0.05）。与CIA组小鼠相比,CIA+Gas6组小鼠AI评分下降,踝关节炎症细胞浸润明显,软骨破坏减轻,血IL-17水平下降而IL-10水平升高（均P＜0.05）;同时CD4+Foxp3+细胞比例明显增加,而CD4+IL-17+细胞比例下降（均P＜0.05）。结论Gas6能够减轻CIA小鼠的关节损伤,机制可能与其抗炎和对Th17/Treg细胞平衡的调控作用有关。     

去细胞肝支架诱导大鼠损伤肝脏再生的研究

【立论依据】 基于结合国内外对肝脏去细胞的研究及前期的基础,利用肝脏去细胞支架在体内诱导损伤肝组织的修复与再生。以解决肝功能衰竭供体缺乏,在外科手术后损失修复与再生的空缺。 【设计思路】 制造肝损伤模型研究去细胞支架对于肝脏损伤修复及再生的作用。 【实验内容】 通过外科手术造成大鼠肝脏损伤,移植去细胞支架修补创面;检测去细胞基质内生长因子含量与移植后支架内细胞的类型;观测移植后肝脏形态及内部结构的改变与蛋白表达情况。 【材料】 去细胞肝脏支架。 【可行性】 去细胞支架相较于其他生物材料具有完全模拟机体细胞的生存环境;去细胞支架含有的一系列黏附分子及生长因子是细胞与组织再生的关键因素;运用去细胞支架体外培养细胞已初具成效。 【创新性】 相较国外针对去细胞支架的体外研究,体内移植能模拟真正的体内生理环境;运用新型生物材料修复肝损伤。     

穿龙薯蓣皂苷元对CIA小鼠脾脏Treg细胞的影响

目的:在胶原性关节炎小鼠模型中初步探讨穿龙薯蓣皂苷元对其脾脏Treg细胞的影响.方法:通过将鸡Ⅱ型胶原乳剂与弗氏完全佐剂混合后免疫DBA1/J小鼠,建立胶原性关节炎(CIA)模型.通过免疫磁珠分离法(MACS)分选CIA小鼠脾脏中的CD4+CD25+Treg细胞.流式细胞术检测Treg细胞的纯度,并体外培养.穿龙薯蓣皂...     

血吸虫源性Treg细胞诱导分子的筛选及机制研究

【立论依据及设计思路】 血吸虫病是我国及世界最重要寄生虫病之一,主要因虫卵引起肝脏肉芽肿、纤维化并继发门脉高压症等严重后果,使患者丧失劳动能力、生活自理能力甚至死亡。然而,血吸虫感染后会诱导宿主产生显著的免疫负调控来抑制肝脏病理免疫损害进展,使宿主能存活较长时期,感染呈慢性化。此时,抗体和细胞因子等应答被显著抑制;白喉毒素、BCG等多种疫苗的接种效果被显著削弱;还抑制了由Th1类(如I型糖尿病、克隆性结肠炎等)和Th2类(过敏性哮喘等)应答介导的诸多免疫疾病。迄今,公认血吸虫感染后引起免疫负调控的最重要机制是虫卵抗原诱导了具有免疫抑制力的CD4⁺CD25⁺ Treg细胞,但诱导机制未明。 【实验内容】 为从血吸虫卵中找到可诱导Treg细胞的分子并阐明诱导机制,拟:(1)以两套方案同时初筛:第一方案参照已知可诱导Treg细胞的表位(Treg细胞表位,Tregitope),在虫卵基因库中筛选含有表位最多的分子用于Treg细胞体外诱导实验,选择诱导能力最强者。第二方案参照已知可诱导Treg细胞的分子特点,在虫卵基因库中选择最相似分子用于Treg细胞体外诱导实验,选择诱导能力最强者。(2)将上述两方案中初筛到的分子免疫小鼠,以体内实验复核其对Treg细胞的诱导能力。(3)最终选取一个诱导作用最强的分子,以哮喘或免疫性关节炎小鼠疾病模型进行免疫抑制功能验证(治疗性)实验。(4)初步探索该分子诱导Treg细胞的机制。 【可行性】 (1)已通过生物信息学分析在虫卵基因库中筛选到数个含Tregitope最多的虫卵蛋白分子;(2)已通过生物信息学分析结合体外诱导和小鼠免疫实验筛选到数个可诱导Treg细胞的虫卵蛋白分子。 【创新性】 不仅有助于揭示慢性感染时宿主控制病理免疫损害的机制,还期待从血吸虫卵中找到可用于新型免疫抑制剂研发的具有自主知识产权的分子。