酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型．方法：采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性．结果：原代培养成功率为77．8％．获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，     

人牙龈上皮细胞的原代和传代培养

目的：研究人龈上皮细胞体外原代和传代培养，建立能够体外长期培养的人龈上皮细胞系。方法：取健康龈组织块，经0．25％分离酶作用后．将上皮组织与其下的结缔组织分离，0.125％胰酶消化上皮组织形成细胞悬液，接种培养。当细胞汇合达80％时，1：2传代培养。结果：获得的原代培养细胞表达细胞角蛋白，结合细胞形态。可初步认定为龈上皮细胞。原代培养的人龈上皮细胞部分可以传代培养到第3代。结论：建立能够长期体外培养的龈上皮细胞系具一定可行性。     

人视网膜色素上皮细胞的培养

目的 :培养人视网膜色素上皮细胞 ,为采用视网膜色素上皮移植治疗色素变性奠定基础。方法 :用胰酶消化法获取人胎儿视网膜色素上皮细胞进行原代及传代培养。角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果 :视网膜色素上皮细胞在体外生长良好 ,胞浆内含有丰富的色素颗粒。抗角蛋白反应阳性。结论 :体外培养视网膜色素上皮细胞成功为细胞移植提供了一个良好的来源     

酶消化组织块法培养人牙髓细胞

目的建立用酶消化组织块培养人牙髓细胞的方法。方法用酶消化组织块进行人牙髓细胞体外培养,倒置显微镜和透射电镜分别观察牙髓细胞形态、生长情况和超微结构,取第5代牙髓细胞测定生长曲线、免疫组化法鉴定组织来源,并检测其矿化能力。结果用酶消化组织块培养的人牙髓细胞成纤维细胞样,接种4天大部分组织块能有效贴附于培养瓶壁,第7天可见组织块边缘有细胞延展生长,第14天复层生长,呈网状,可顺利传代;牙髓细胞抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;细胞I型胶原染色阳性,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节,符合牙髓细胞的形态学特征和生物学特性。结论酶消化组织块培养人牙髓细胞方法简单可行,具有较高的成功率。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养

目的:培养人口腔黏膜上皮细胞,建立稳定的人正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系,为进一步采用组织工程技术构建口腔黏膜组织奠定基础。方法:取3个月唇裂患儿手术多余口腔黏膜,经Dispase及胰蛋白酶消化获取细胞,采用无血清角化细胞培养液进行原代培养,并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等细胞定性研究。结果:在0.25×10~2个细胞的低密度接种下,经过20天培养,获得了完全融合成片的口腔黏膜原代细胞,细胞呈铺路石样生长,经鉴定为单一的口腔黏膜上皮细胞。结论:正常口腔黏膜组织经Dispase及胰蛋白酶消化,应用无血清培养液进行培养,可成功培养出人正常口腔黏膜上皮原代细胞。     

人胎视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏

目的：冻存和复苏人胎视网膜色素上皮细胞，为视网膜色素上皮移植治疗视网膜色素变性提供组织来源。 方法：取第3代胰酶消化法获取的人胎儿视网膜色素上皮细胞进行冻存，复苏后经台盼蓝染色测定细胞存活率，角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。 结果：复苏后的视网膜色素上皮细胞在体外生长良好，抗角蛋白反应阳性，细胞具有较高的存活率［(84.9%±3.2)%］。 结论：冻存和培养RPE细胞为细胞移植提供了一个良好的来源。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性

目的 探讨体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性,为构建组织工程尿道提供种子细胞.方法 取尿道下裂患者尿道黏膜,经消化离心后,接种于培养基中连续培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并绘制生长曲线;对细胞进行常规冻存和复苏;应用免疫细胞化学技术进行角蛋白染色的鉴定.结论 体外培养的细胞呈铺路石样外观,可传至8代;可进行常规冻存和复苏;角蛋白免疫细胞化学染色呈阳性.结论人尿道黏膜上皮细胞的体外连续培养及扩增技术被建立,本实验培养的细胞可用于构建组织工程尿道.     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率，确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法，建立兔结膜上皮细胞系，为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养，在不同时间观察细胞的形态，并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢，胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染，DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

甲床细胞体外培养的实验研究

目的探讨甲床上皮细胞及成纤维细胞体外培养的可行性。方法取20周以上引产胎儿的甲床,采用组织块培养法进行原代培养获得甲床上皮细胞和成纤维细胞,观察细胞形态,进行HE染色,免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,甲床上皮细胞检测皮肤型角蛋白17,成纤维细胞检测波形蛋白。结果甲床上皮细胞培养2～3 d从组织块中游出,并在组织块周围形成生长晕,13 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%,扁圆形细胞,呈铺路石样排列。70%以上特异性角蛋白17抗体染色阳性,证明培养的细胞为甲床上皮细胞;甲床成纤维细胞培养3 d观察可见组织块周围有许多生长的细胞,细胞呈现圆或长梭形、等成纤维细胞的特征,胞体丰富,胞质均匀,细胞核清晰可见,11 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%。培养甲床成纤维细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,说明培养的细胞为成纤维细胞。结论通过组织块法成功培养出甲床上皮细胞及成纤维细胞,为组织工程甲床的深入研究奠定了基础。     

人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层的研究

目的：探讨人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞代替鼠源饲养层细胞在体外培养人口腔黏膜上皮细胞的可行性。方法：通过酶消化法从人眼睑组织中分离成纤维细胞传代培养，取P5代成纤维细胞通过丝裂霉素C方法制备饲养层细胞，将其制备成的饲养层细胞用来培养商品化人口腔黏膜上皮细胞。通过罗丹明染色观察其细胞克隆形成率；HE染色观察细胞片层的结构；免疫荧光检测特征蛋白P63、β1-integrin的表达。结果：人眼睑组织来源的成纤维细胞在体外具有较强的增殖能力，高表达成纤维细胞特异性标志性蛋白CD90，培养的人口腔黏膜上皮细胞呈克隆样生长，细胞克隆形成率约为2.2%，并将其构建成3～4层口腔黏膜细胞片层，且高表达上皮细胞标志物P63及β1-integrin。结论：人眼睑组织来源的成纤维细胞可以作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层，为临床应用提供一种新的人源化饲养层工具细胞。     

以膀胱脱细胞基质为支架材料体内外构建组织工程化尿路上皮

目的:探讨利用组织工程技术体内外构建尿路上皮组织的方法.方法:制备新西兰兔膀胱脱细胞基质材料(bladder acellular matrix graft,BAMG),通过Masson染色和扫描电镜观察材料结构特点.酶消化法获取兔膀胱上皮细胞,体外培养扩增,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,并以免疫组织化学方法进行细胞鉴定.将膀胱上皮细胞与BAMG体外复合培养,HE染色和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况.将体外培养的细胞-材料复合物植入裸鼠体内,分别在4周和8周取材,进行大体观察、组织学以及免疫组织化学方法检测.结果:制备的BAMG呈白色半透明薄膜状,扫描电镜下为纤维网状结构,无细胞残留.体外培养的膀胱上皮细胞呈"铺路石"样外观,抗细胞角蛋白AE1/AE3免疫组化染色胞浆呈棕黄色阳性反应.膀胱上皮细胞接种到BAMG 7 d后,细胞铺满材料的表面,呈单层细胞结构.裸鼠体内植入4周和8周后,细胞-材料复合物形成多层细胞结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色呈阳性.结论:采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮组织,这可为进一步进行组织工程泌尿道修复及重建奠定基础.     

体外培养人牙周膜细胞方法的探讨

目的:研究如何提高体外培养人牙周膜细胞(hPDL)的成功率,为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞,建立体外细胞模型提供一定的实验方法.方法:利用3种不同方法(组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法)进行牙周膜细胞的原代培养,用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源;通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性.结果:3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同;波丝蛋白抗体染色阳性,角蛋白抗体染色阴性.组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法.结论:通过对牙周膜细胞培养方法的改良,可以显著提高hPDL原代培养的成功率.     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响

目的 探讨藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响.方法 DispaseⅡ及胰酶消化法原代培养人口腔黏膜上皮细胞,传代后HE染色,光镜下进行形态学观察.免疫组织化学抗角蛋白抗体染色,进行来源鉴定.取第二代培养细胞,随机分为4个实验组和1个对照组.制备藓化饮药液,实验组分别加入经无血清培基稀释为104、105、5×105、106μg/L 4个浓度梯度的藓化饮液继续培养;对照组只加无血清培基继续培养.甲基噻唑基四唑法测定培养细胞的增殖活性.结果 原代培养的人口腔黏膜上皮细胞呈扁平椭圆形或多角形,胞核清晰.细胞抗角蛋白抗体染色阳性.藓化饮在105μg/L浓度下增殖活性吸光度值明显高于其他浓度组和对照组(P＜0.05).而在104μg/L、5×105μg/L、106μg/L浓度下增殖活性吸光度值虽高于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 使用无血清培养基可成功进行人口腔黏膜上皮细胞原代培养及传代培养.藓化饮在浓度为105μg/L下能明显增强体外培养的人口腔黏膜上皮细胞的增殖活性.     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

牙源性角化囊性瘤上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:建立牙源性角化囊性瘤上皮细胞体外培养体系并进行初步鉴定.方法:采用组织块及酶消化法原代培养牙源性角化囊性瘤上皮细胞,以无血清的角化上皮细胞培养基进行体外连续培养,并行细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定.结果:体外培养的牙源性角化囊性瘤上皮细胞为多角形,胞浆均匀,轮廓清晰,表现上皮细胞特有的铺路石样外观,体外可传2～4代,生长周期约30～50 d.经波形丝蛋白、广谱角蛋白及角蛋白10、角蛋白14免疫组化染色证实,分离培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂.结论:采用无血清的角化细胞培养基可在体外进行牙源性角化囊性瘤上皮细胞的连续培养.     

人大肠癌细胞体外分离与培养

目的:探讨人大肠癌细胞体外分离培养的方法.方法:采用组织块法和Ⅳ胶原酶消化法体外培养人大肠癌细胞,HE染色、免疫细胞化学判断细胞的组织来源、TEM观察细胞形态,MTT法绘制细胞生长曲线.结果:采用组织块法细胞培养成功,HE染色显示核大蓝染, 细胞角蛋白鉴定胞浆黄染,细胞角蛋白阳性;透射电镜下,见细胞内丰富的线粒体、表面微绒毛、细胞间连接复合体结构;细胞生长曲线为"S".结论:组织块法原代培养细胞成功率高,需注意在取材、分离操作过程中保持无菌,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。