携带K5基因突变体的腺病毒构建及K5蛋白表达

 目的 对血管生成抑制因子纤溶酶原Kringle 5（K5）基因进行突变，构建于重组腺病毒中，并观察突变后K5蛋白的表达情况。方法 用重叠延伸技术对K5基因Furin蛋白酶水解识别位点进行定点突变，分别构建携带K5基因和突变后的K5m基因表达框的腺病毒载体Ad-EF1-K5/K5m；用RT-PCR法比较腺病毒感染TC-1细胞后K5和K5m mRNA的表达；用免疫沉淀和Western blot法比较腺病毒感染TC-1细胞后K5蛋白和突变后K5蛋白的表达。结果 成功对K5基因进行点突变，携带K5突变基因腺病毒K5蛋白表达量明显多于携带未突变K5基因腺病毒。 结论 对K5基因Furin蛋白酶水解识别位点进行定点突变能提高腺病毒介导的K5蛋白分泌表达量，为进一步以腺病毒为载体携带K5基因在眼部新生血管异常增生性疾病的实验研究提供基础。     

雷公藤对致敏小鼠T细胞活化及其IL-5 mRNA表达的影响

目的　探讨致敏小鼠T淋巴细胞活化与IL 5mRNA表达间的关系及雷公藤内酯醇 (TP)的影响。方法　采用卵蛋白(OVA )致敏的方法建立模型 ;运用免疫细胞化学与原位杂交双染法 (ICC ISH)观察活化的T淋巴细胞 (CD2 5 )与IL 5mRNA表达的相关性及TP、地塞米松 (DM)的影响 ;同时就TP的作用与DM相比较。结果　致敏小鼠T淋巴细胞CD2 5与IL 5mRNA表达均显著高于正常对照组 (P <0 0 1)。CD2 5 IL 5mRNA双染结果显示 :CD2 5 + IL 5mRNA+ T淋巴细胞显著高于正常对照组 (P <0 0 1) ,CD2 5 - IL 5mRNA- T淋巴细胞显著低于正常对照组 (P <0 0 1) ,CD2 5 + IL 5mRNA- 及CD2 5 - IL 5mRNA+ T淋巴细胞与正常对照组间无显著差异(P >0 0 5 )。经TP、DM处理后 ,致敏小鼠T淋巴细胞CD2 5与IL 5mRNA表达均显著低于致敏组 (P <0 0 1)。CD2 5 IL 5mRNA双染结果显示 :CD2 5 + IL 5mRNA+ T淋巴细胞显著低于致敏组 (P <0 0 1) ,CD2 5 - IL 5mRNA- T淋巴细胞显著高于致敏组 (P <0 0 1) ,而CD2 5 + IL 5mRNA- 及CD2 5 - IL 5mRNA+ T淋巴细胞与致敏组间无显著性差异 (P >0 0 5 )。TP组与DM组间无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论　IL 5mRNA表达与T淋巴细胞活化关系密切。TP、DM抑制T淋巴细胞活化可能是其抑制IL 5产生的机制之     

5-氮杂-5'-脱氧胞苷的合成工艺优化及其对SKOV3作用

目的研究优化5-氮杂-5'-脱氧胞苷(5A5DC)的合成工艺,并观察其对卵巢癌细胞SKOV3的作用。方法通过正交设计比较在Hilbert-Johnson偶联反应中不同Lewis酸、催化剂对合成5A5DC的影响;通过绘制细胞生长曲线及四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原检测,观察不同浓度5A5DC对体外培养卵巢癌细胞株SKOV3的作用。结果当以无水SnCl4为催化剂、1,2-二氯乙烷为Lewis酸时,5A5DC的收率最高。以双氰胺计,总收率为31%;5A5DC呈浓度依赖抑制SKOV3细胞增殖,以200μmol/L抑制作用较强。结论本研究优化了5A5DC的合成工艺,5A5DC对SKOV3有一定的增殖抑制作用。     

微小染色体维持蛋白5在斑马鱼脑发育中的作用及机制研究

目的 观察微小染色体维持蛋白5(mcm5)在斑马鱼脑发育中的作用及机制.方法 将90枚斑马鱼胚胎分为3组:对照组[CONT组,注射无意义的吗啉基寡核苷酸(MO)]、mcm5 MO组(注射mcm5特异的MO)和mcm5 MO+mcm5mRNA组(同时注射mcm5特异的MO和mcm5 mRNA),每组30枚,观察mcm5 ...     

内源性siRNA对RAB5A和RABEX5表达的抑制作用

目的 研究内源性的siRNA对RAB5A和RABEX5表达的抑制作用.方法 利用siRNA表达载体 pSilencerTM 2.1U6-neo对RAB5A和RABEX5基因分别构建3个特异的siRNA表达载体,并将表达载体分别转染人卵巢癌高转移细胞HO-8910PM.应用逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测转染前后HO-8910PM细胞中RAB5A和RABEX5的表达情况,并用荧光免疫细胞化学技术对干扰效率最好的载体进行验证.结果 在构建的6个siRNA表达载体中, pSilencer/siRAB5A-1和pSilencer/siRAB5A-2对RAB5A表达的抑制率分别为90%和70%,pSilencer/siRAB5A-3对RAB5A表达没有抑制作用.pSilencer/siRABEX5-1、pSilencer/siRABEX5-2和pSilencer/siRABEX5-3对RABEX5表达的抑制率分别为30%、50%和90%.结论 成功构建了对RAB5A和RABEX5表达具有抑制作用的siRNA表达载体,为进一步研究RAB5A和RABEX5的生物学功能提供了实验工具.     

透析膜和内毒素对外周血单个核细胞细胞因子产生的影响

目的　研究不同透析膜和内毒素对正常人和尿毒症患者外周血单个核细胞 (PBMC)肿瘤坏死因子 α(TNF α)及其可溶性受体p5 5 (TNFsRp5 5 )产生的影响。 方法　与不同透析膜或内毒素孵育后的PBMC培养后采用酶联免疫吸附法测定细胞总TNF α和TNFsRp5 5水平。 结果　在未用内毒素时 ,铜仿膜、聚砜膜孵育组和对照组PBMCTNF α和TNFsRp5 5生成量无显著差异 ;内毒素刺激后的PBMCTNF α和TNFsRp5 5产生量显著高于相应的未用内毒素刺激组 ,而铜仿膜刺激组又明显高于聚砜膜和对照组 ;尿毒症患者PBMC受内毒素刺激后TNF α和TNFsRp5 5升高幅度明显小于正常人 ;PBMCTNF α与TNFsRp5 5产生量呈正相关。 结论　内毒素和透析膜对尿素症患者PBMCTNF α及TNFsRp5 5合成具有协同作用 ;尿毒症患者PBMC存在着对内毒素刺激反应低下 ;TNFsRp5 5可能是炎症反应的标记物而不是调节剂。     

bcl-2、bax和p53在非小细胞肺癌中的表达

目的　探讨bcl 2、bax和p5 3蛋白与非小细胞肺癌 (non smallcelllungcancer,NSCLC)临床及病理特征的关系。方法　应用免疫组化方法检测 5 5例手术切除NSCLC标本中三种基因蛋白的表达。结果　 5 5例标本中bcl 2蛋白表达率为 5 6 .36 % (31/ 5 5 ) ,bax蛋白表达率为 6 3.6 4 % (35 / 5 5 ) ,p5 3蛋白表达率为 6 5 .4 5 % (36 / 5 5 ) ;bcl 2随分化程度降低而降低 ,p5 3阳性表达率随分化程度降低而升高 ,且两者在高、低分化组间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;p5 3阳性表达率在淋巴结转移与无淋巴结转移间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;bax阳性表达率随分化程度降低而降低 ,但高、低分化组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;三种基因蛋白阳性表达率与肺癌组织学类型均无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;bcl 2和bax与淋巴结转移无明显关系。结论　bcl 2 /bax蛋白与NSCLC发生、发展有关 ,p5 3蛋白与NSCL .C分化程度及预后有关 ,可作为反映NSCLC生物学行为的指标。     

RABEX-5和RAB5在乳腺癌中的表达及意义

目的 初步探讨RABEX-5和RAB5与乳腺癌的关系.方法 采用免疫组织化学法、RT-PCR和Western blot法检测RABEX-5及RAB5 mRNA和蛋白在60例乳腺癌、15例乳腺纤维腺瘤和15例乳腺正常组织中的表达,并检测相关临床病理指标与RABEX-5及RAB5表达的关系.结果 RABEX-5和RAB5 ...     

鞘内靶向沉默5-HT5A受体基因对化疗痛的影响

目的:观察鞘内注射5-羟色胺5A受体(5-hydroxytrptamine 5A receptor,5-HT5AR)的小干扰RNA重组腺病毒载体(Ad-5-HT5A-siRNA)前后,化疗痛大鼠脊髓5-HT5AR表达和痛觉过敏的变化情况,探讨5-HT5AR在化疗痛中的作用.方法:第一部分雄性成年SD大鼠随机分为模型组(n=10)和对照组(n=10),模型组腹腔注射长春新碱,对照组腹腔注射生理盐水,定期测定大鼠的机械痛阈及RT-PCR检测建模结束时大鼠脊髓L4.5段5-HT5AR的mRNA表达.第二部分30只已成功建立化疗痛模型大鼠随机分为3组(n=10),实验组鞘内注射Ad-5-HT5A-siRNA,阴性对照组鞘内注射阴性对照腺病毒(Ad-X-HK),空白对照组鞘内注射生理盐水.鞘内注射后3、7 d检测各组脊髓L4.5段5-HT5AR的表达,并分别在鞘内注射前及注射后3、5、7 d测定机械痛阈.结果:腹腔注射长春新碱可引起模型组大鼠机械痛阈下降(P＜0.01)和脊髓5-HT5AR的mRNA表达增高.而鞘内注射Ad-5-HT5A-siRNA后7 d,实验组大鼠5-HT5AR的mRNA表达下降,同时该组大鼠的机械痛阈降低(与阴性对照组、空白对照组比较,P＜0.05).结论:5-HT5AR参与了化疗痛的调控过程,其表达增强时可能有减轻化疗痛的作用.     

HKa轻链D5区及其合成肽对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Hka轻链D5区对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其发挥活性作用的功能区。方法通过制备HKaD5区重组蛋白(r-HRD)及其D5区合成肽P-5、P-5n、P-5m、P-5c,采用WST法和AnnexinⅤ/PI双标记法检测HKa轻链D5区及其合成肽对MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响。结果合成肽P-5、P-5n、P-5m能抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导MDA-MB-231细胞凋亡;P-5c无抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用。相差显微镜观察细胞形态改变,发现肽P-5、P-5n、P-5m处理组细胞体积缩小、变圆,细胞生长受抑制,活力下降;P-5c处理组与对照组相比无差异。结论合成肽P-5、P-5n、P-5m抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用是通过诱导细胞凋亡实现的,组-甘-赖氨酸序列可能是其发挥活性作用的核心序列。     

师生对临床见习“5＋5”模式的认知度研究

目的：通过问卷调查的形式对临床见习＂5＋5＂模式进行认知调查,评价临床见习＂5＋5＂模式的认知度。方法：采用无记名的方式,对实验组48名老师和900名学生进行问卷调查,研究临床见习＂5＋5＂模式的实施效果。结果：带教老师对临床见习＂5＋5＂模式的评价普遍较好,学生的评价普遍一般。结论：临床见习＂5＋5＂模式的实施效果较好或一般。     

内源性siRNA对RAB5A和RABEX5表达的抑制作用

目的研究内源性的siRNA对RAB5A和RABEX5表达的抑制作用。方法利用siRNA表达载体pS ilencerTM2.1U6-neo对RAB5A和RABEX5基因分别构建3个特异的siRNA表达载体,并将表达载体分别转染人卵巢癌高转移细胞HO-8910PM。应用逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测转染前后HO-8910PM细胞中RAB5A和RABEX5的表达情况,并用荧光免疫细胞化学技术对干扰效率最好的载体进行验证。结果在构建的6个siRNA表达载体中,pS ilencer/siRAB5A-1和pS ilencer/siRAB5A-2对RAB5A表达的抑制率分别为90%和70%,pS ilencer/siRAB5A-3对RAB5A表达没有抑制作用。pS ilencer/siRABEX5-1、pS ilencer/siRABEX5-2和pS ilencer/siRABEX5-3对RABEX5表达的抑制率分别为30%、50%和90%。结论成功构建了对RAB5A和RABEX5表达具有抑制作用的siRNA表达载体,为进一步研究RAB5A和RABEX5的生物学功能提供了实验工具。     

具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化

目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5(K5)突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因(模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变),通过PCR从本实验室保存的pET22b(+)/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。     

编码人白细胞分化抗原5D4的基因表达

目的确证 5D4 cDNA是全长 cDNA,并为制备抗 5D4不同表位的单克隆抗体准备抗原。方法构建重组表达质粒 pGEX- 5X- 3- 5D4全长和 pGEX- 5X- 3- 5D4 5′侧 ,并转化大肠杆菌 DH5α ,使其表达 5D4分化抗原,用 Northern印迹分析和 RT- PCR检测 5D4 mRNA在不同组织和免疫细胞株中的表达状况。结果 5D4 mRNA有 5种转录本,它们在不同组织有不同的表达, 1.9 kb RNA在所检测的 8种组织中只见于小肠组织和脾脏。 5D4 mRNA在不同免疫细胞的表达量不同。在大肠杆菌 DH5α中表达出了相对分子质量约为 66 000和 60 000的 5D4- GST融合蛋白。结论 1 846 bp 5D4 cDNA为全长 cDNA,并在大肠杆菌 DH5α中成功表达出了与 GST融合的 5D4分化抗原全长 (66 000)及其跨膜区侧氨基端蛋白质 (60 000)。     

5-HTT基因多态性与情感障碍发病及SSRIs疗效的相关性分析

5-HTT基因多态性与情感障碍抑郁症发病及SSRIs疗效的相关性研究是目前研究的热点之一。关于5-HTT基因、5-HTTLPR（包括5-HTTLPR与5-HTT基因表达的调控密切相关、5-HTTLPR与情感障碍抑郁症的关系、5-HTTLPR与SS—RIs抗抑郁疗效的关系）、5-HTTLPR与SSRIs、5-HTT-3’UTRG／T值得进一步探讨，现就此作一综述。     

TET酶及其中间产物5hmC研究进展

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,在胚胎重编程、干细胞分化和肿瘤的发生中发挥调控作用。 TET(ten-eleven translocation)酶为关键的去甲基化酶,可连续将 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)氧化为 5-羟甲基胞嘧啶(5-hydro-xymethylcytosine,5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和 5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC),这些碱基代表DNA的表观遗传修饰状态,同时调控DNA去甲基化的进程。研究TET蛋白如何调控DNA甲基化修饰和基因的表达有助于我们深入了解正常的生长发育和人类疾病的表观调控。     

lncRNA HCP5对氧糖剥夺/复氧诱导的神经细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)人类组织相容性白细胞抗原复合物P5(HCP5)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经细胞损伤的影响, 并分析其潜在机制。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组(CON组, 正常培养基培养)、模型组(Model组, 进行OGD/R)、干扰对照组[si-NC组, 转染HCP5小分子干扰RNA阴性对照(si-NC)后进行OGD/R)]、HCP5干扰组[si-HCP5组, 转染HCP5小分子干扰RNA(si-HCP5)后进行OGD/R]、HCP5干扰+抑制剂对照组[si-HCP5+anti-NC组, 转染si-HCP5、miR-525-5p抑制剂阴性对照(anti-NC)后进行OGD/R]、HCP5干扰+miR-525-5p抑制剂组[si-HCP5+anti-miR-525-5p组, 转染si-HCP5、miR-525-5p抑制剂后进行OGD/R]。qRT-PCR检测细胞中lncRNA HCP5、miR-525-5p的表达;MTT检测SH-SY5Y细胞活性;二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平;流式细胞术检测SH-SY...     

多巴胺D5受体转基因小鼠的建立

目的建立人多巴胺D5受体突变基因F173 L（D5F173L）,S390G（D5S390G）及正常人D5基因（hD5 WT）的转基因小鼠,利用该转基因动物模型来研究D5受体在原发性高血压中的发病机制。方法利用显微注射的技术将插入CMV启动子下游的D5F173L,D5S390G及hD5 WT基因的转基因载体注射入C57BL/6小鼠体内,建立多巴胺D5F173L,D5S390G及hD5 WT的转基因小鼠。通过PCR鉴定转基因小鼠的基因型。利用Western Blotting方法鉴定该受体蛋白在肾脏的表达情况。使用智能无创血压测量仪测量转基因小鼠的血压值。结果分别建立了多巴胺D5F173L,D5S390G及hD5 WT转基因C57BL/6小鼠,Western Blotting方法鉴定结果显示,与非转基因C57BL/6小鼠比较,D5转基因小鼠D5受体在肾脏有较高的表达。3-6月龄D5 F173L转基因小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉血压均明显高于多巴胺D5S390G及hD5 WT转基因小鼠（n=6-8,P〈0.05）。结论多巴胺D5受体在原发性高血压发病中具有重要作用,但作用机理还有待于进一步研究。     

醒脾开郁方对抑郁症大鼠模型的中枢单胺类递质的影响

目的研究醒脾开郁方对抑郁症大鼠模型海马及皮层的单胺类递质的影响.方法结合分养及慢性不可预见性应激的方法造成大鼠抑郁模型,应用高效液相色谱-电化学检测器观察大鼠海马及皮层单胺类递质和其代谢产物的变化,以探讨醒脾开郁方抗抑郁的机制.结果模型组大鼠海马及皮层5-羟色胺(5-HT)含量明显低于正常组,海马3,4二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA) 、DOPAC/多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)/5-羟色胺(5-HT)及皮层5-HIAA/5-HT均明显高于正常组.醒脾开郁方可明显升高慢性应激抑郁模型大鼠海马及皮层5-HT,降低海马DOPAC、HVA含量,并降低海马 DOPAC/DA 、5-HIAA/5-HT和皮层5-HIAA/5-HT.结论提示醒脾开郁方通过降低海马和皮层5-HT及DA的代谢,相对升高海马5-HT、DA及皮层5-HT含量而发挥抗抑郁作用.     

miR-485-5 p介导SOX5基因表达对肝细胞肝癌细胞活力及迁移侵袭的影响

目的 研究微小RNA(miR)-485-5 p靶向性别决定区Y框蛋白5(SOX5)对肝细胞肝癌(HCC)细胞活力和迁移侵袭能力的影响及作用机制.方法 采用Targetscan 7.1预测软件及双荧光素酶报告基因试验检测miR-485-5 p对SOX5基因的靶向调控作用.qRT-PCR检测HCC组织中miR-485-5 p和SOX5 mRNA的表达水平,并分析两者的相关性.常规培养HCC细胞Huh7,将其分为NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组,采用lip2000进行各组质粒的转染.CCK-8实验检测各组细胞的活力,Transwell实验检测各组细胞的迁移侵袭能力.Western blot检测各组细胞中pAkt和pGSK3β蛋白的表达.结果 Targetscan 7.1预测软件、双荧光素酶报告基因试验表明miR-485-5 p靶向调控SOX5.与HCC癌旁组织相比,miR-485-5 p在HCC组织中低表达,SOX5 mRNA在HCC组织中高表达,两者的表达呈负相关性.与NC组相比,miR-485-5 p mimic组和miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组HCC细胞活力和迁移侵袭能力降低.而与miR-485-5 p mimic组相比,miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组HCC细胞活力和迁移侵袭能力增加,过表达SOX5减弱了miR-485-5 p mimic对HCC细胞活力和迁移侵袭能力的抑制作用.与NC组相比,miR-485-5 p mimic和miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组细胞中pAkt和pGSK3β蛋白表达降低.而与miR-485-5 p mimic组相比,miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组pAkt和pGSK3β蛋白表达增加,过表达SOX5减弱了miR-485-5 p mimic对Akt/GSK3β信号通路活性的抑制作用.结论 miR-485-5 p靶向调控SOX5表达抑制HCC细胞活力及迁移侵袭能力.