负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞对大鼠Th细胞增殖的影响

目的 探讨负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞对大鼠Th细胞增殖的影响.方法 将CTLA4Ig重组腺病毒与Wistar大鼠未成熟树突状细胞于37C共孵育6h后,经尾静脉注射该大鼠作实验组,另外分别设立Wistar大鼠未成熟树突状细胞、CTLA4Ig重组腺病毒、生理盐水经尾静脉注射为对照.1周后,用0.3%戊巴比妥麻醉各组大鼠后抽血检测CTLA4Ig.取脾脏,经流式细胞术分选出Th1、Th2细胞及CD4+T细胞,行混合淋巴细胞培养检测Th细胞的增殖.用免疫组织化学法检测Th1、Th2细胞的比例.结果 实验组血清CTLA4Ig水平(0.654±0.13)显著高于CTLA4Ig重组腺病毒组(0.392±0.10,P＜0.01),树突状细胞组及生理盐水组未检出.实验组Th1细胞的增殖指数(742±161)、Th1/Th2(0.16±0.05)均显著低于各对照组(分别与未成熟树突状细胞组、CTLA4Ig重组腺病毒组、生理盐水组相比,P均＜0.01);而Th2细胞的增殖指数(9162 ±598)显著高于各对照组(P均＜0.01).结论 负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞可显著抑制大鼠Th1细胞增殖,促进Th2细胞增殖,使Th细胞由Th1向Th2显著偏移,诱导有效的免疫耐受.     

CTLA4Ig修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的：探讨CTLA4Ig修饰的DC对实验动物免疫功能的影响。方法：将经CTLA4Ig基因修饰或未修饰Dc腹腔注射C57BL／6致敏小鼠，以致敏或未致敏C57BL／6单个核细胞作为反应细胞，以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞，共培养6天，采用MTT比色法检测细胞增殖，乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性。结果：CTLA4Ig融合蛋白对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用。CTLA4Ig修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应均明显降低，CTLA4Ig融合蛋白对CTL细胞毒活性有显著抑制作用。CTLA4Ig修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性均具有抵抗作用，未修饰DC细胞对未致敏小鼠以及未修饰DC对致敏小鼠CTL细胞毒活性敏感。结论：稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC诱导显著降低同种小鼠淋巴细胞的增殖反应和对CTL细胞毒活性的抵抗。     

负载pCTLA4-Ig基因的猪未成熟树突状细胞抑制异种脾细胞的增殖

目的:建立猪外周血来源的未成熟树突状细胞(im-DC)体外诱导、扩增方法。探讨负载猪源性pCTLA4-Ig重组腺病毒的猪imDCs对大鼠脾细胞增殖的影响。方法:家猪外周血单个核细胞(PBMC),以rpGM-CSF(30μg/L)和rpIL-4(20μg/L)体外诱导培养,收集悬浮细胞经电镜、流式细胞仪鉴定。利用Adv-pCTLA4-Ig转染猪imDCs,RT-PCR鉴定。对比转染组与未转染组imDCs刺激SD大鼠脾细胞增殖的能力。结果:获得第4～5天悬浮细胞具有典型的imDCs形态特征,表达猪源性DC的特异性标志SLA-DR、CD172a,而CD80/CD86表达较低。Adv-pCTLA4-Ig转染猪imDCs行RT-PCR出现pCTLA4-Ig、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)基因的表达。混合淋巴细胞培养转染组与未转染组imDCs刺激指数有显著性差异(P0.05)。结论:联合应用rpGM-CSF和rpIL-4可诱导猪PBMC衍生成大量的imDCs。负载pCTLA4-Ig基因的猪imDCs,能够表达IDO,降低对异种抗原的免疫应答,显著抑制异种脾细胞增殖。     

CTLA4Ig修饰的树突状细胞在体外对淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的:探讨CTLA4Ig修饰的树突状细胞(DC)对T细胞增殖和细胞毒性T细胞(CTL)细胞毒活性的影响。方法:采用脂质体转染法,将质粒pG/CTLA4Ig转入DC。采用ELISA和SDS-PAGE鉴定转染质粒pG/CTLA4Ig的DC培养上清。以C57BL/6小鼠的单个核细胞作为反应细胞,以未修饰的DC及修饰的DC作为刺激细胞,共培养6 d,用MTT比色法检测细胞的增殖。用乳酸脱氢酶法和ELISA法,分别测定细胞毒活性及T细胞凋亡。结果:CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对同种细胞刺激的增殖反应有明显地抑制作用;而未修饰的DC可显著诱导淋巴细胞增殖反应。CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对特异性CTL的细胞毒活性有明显地抑制作用,且可诱导T细胞凋亡。结论:稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC,对T细胞增殖和对CTL的细胞毒活性具有明显地抑制作用,并可诱导T细胞凋亡。     

CTLA4-Ig基因修饰的树突状细胞体外对Th1/Th2平衡的影响

目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4 Ig)基因修饰的树突状细胞(CTLA4 Ig-DCs)体外对Th1/Th2平衡的影响。方法:通过腺病毒载体将目的基因(CTLA4 Ig)转染至小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。采用流式细胞术(FCM)检测DC表面分子和胞内CTLA4 Ig的表达;采用混合淋巴细胞反应检测DC刺激同种异体T细胞的能力,ELISA法检测DC抗原提呈反应中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。结果:CTLA4 Ig基因成功转染至DC,转染率约为80%,制备的CTLA4 Ig-DCs稳定表达CTLA4Ig,表面分子CD86呈现低表达;CTLA4 Ig-DCs可有效抑制T细胞增殖,降低抗原提呈反应上清中IFN-γ和IL-4的分泌,并增加IFN-γ/IL-4比值。结论:通过腺病毒将CTLA4 Ig转染DC并且高效表达,可有效降低DC表面CD86分子,抑制同种异体T细胞反应,并能影响体外Th1/Th2水平。     

CTLA4Ig抑制T细胞增殖的体外研究

目的 观察CTLA4Ig在人外周血T细胞增殖反应中的作用。方法 植物血凝素（PHA）、脂多糖（LPS）、金葡菌肠毒素B（SEB）刺激T细胞增殖,在加入或未加入CTLA4Ig情况下,观察细胞形态并检测^3H-TdR掺入量。结果ＣＴＬＡ４Ｉg对ＰＨＡ、ＬＰＳ的抑制作用呈剂量依赖关系。而CTLA4Ig浓度只高于5ug/mL时,对SEB才有抑制作用。且可完全抑帛。结论CTLA4Ig对PHA、LPS、SEB刺激下的T细胞增殖反应有明显的抑制作用。但反应模式不一致。     

腺病毒介导CTLA4Ig和Iκ-Bα双基因在ECV304细胞中的表达

目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白 (Iκ- Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达。方法: 将Iκ- Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2 )连接, 并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体, 构建重组腺病毒, 检测Iκ- Bα和CTLA4Ig在ECV304细胞中的蛋白表达情况及其对炎症介质TNF的调控效应。结果: ( 1 )构建pAdTrack -CMV- CTLA4Ig IRES2- Iκ-Bα, 与pAdEasy在BJ5183重组后转染 293, 获得重组腺病毒。(2)PCR鉴定重组腺病毒正确。(3)用重组腺病毒感染体外培养的ECV304后,该腺病毒可表达Iκ- Bα蛋白及CTLA4Ig蛋白, 且可以下调LPS攻击后TNF α的产生。结论: 构建人CTLA4Ig, Iκ- Bα双基因共表达腺病毒载体, 可以有效的抑制炎症因子的表达,为进一步的CTLA4Ig免疫耐受基因治疗中的抑制, 因NF- κB的过度激活而产生的炎性反应提供研究基础。     

介导CTLA4Ig及IκBα重组腺病毒载体对烧伤创面皮片移植的影响

目的探讨重组CTLA4Ig及IκBα重组腺病毒载体延长烧伤创面皮片移植存活情况。方法采用Wistar大鼠36只,随机分为3组,1组:正常对照组,2组:用AdCTLA4Ig液室温浸泡转染1h,3组:用Adv CD40LIg-IRES2-CTLA4Ig液室温浸泡转染1h。麻醉后常规背部备皮,在4cm×4cm面积上涂3%凝固汽油2ml,燃烧20s,致大鼠背部皮肤Ⅲ度烧伤,于烧伤后第3天,将所制备1.0cm×2.0cm大小长方形皮瓣移植于创面,加压包扎。观察重组腺病毒载体转染移植物后,在大鼠背部烧伤创面移植人断层皮肤的存活情况的影响。结果重组腺病毒载体能延长大鼠烧伤创面移植人断层皮肤的存活时间。结论重组腺病毒可用于延长烧伤创面异基因移植皮肤的存活期。     

FK506和CTLA4Ig转基因腺病毒在耐受诱导中的作用

目的　评价Tacrolimus(FK5 0 6 )和细胞毒性T淋巴相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)转基因腺病毒(AdCTLA4Ig)在耐受诱导中的作用。方法　按照是否接受FK5 0 6处理、心脏移植后有无骨髓细胞输注(bonemarrowtransfusion ,BMT)、术后有无AdCTLA4Ig输注及移植心脏来源,将实验动物随机分为8组,观察各组心脏移植物的存活时间,于术后第30天测定其中4组的混合淋巴细胞反应的特异性和非特异性抑制率以及其中4组的异基因嵌合水平。结果　无处理对照组移植心脏存活时间为(6 .5±0 .5 5 )d ;AdCTLA4Ig单一处理组及联合BMT组移植心脏存活时间分别为(37.5±2 .88)d和(39.2±3.31)d ,与无处理组比较,差异有统计学意义(P <0 .0 5 ) ,当把FK5 0 6处理加入到上述2组的处理方案中时,移植心脏存活时间缩短(P <0 .0 5 )。术后30d混合淋巴细胞反应(MLR)结果显示,AdCTLA4Ig +BMT组和AdCTLA4Ig组的特异性抑制率明显高于FK5 0 6 +AdCTLA4Ig +BMT组和FK5 0 6+AdCTLA4Ig组(P <0 .0 5 ) ,而非特异性抑制率并没有差别。术后30d的异基因嵌合水平检测显示,BMT +AdCTLA4Ig组的胸腺和外周血嵌合水平高于AdlacZ腺病毒组、无处理对照组和AdCTLA4Ig组(P <0 .0 5 )。结论　在耐受诱导过程中,当FK5 0 6和AdCTLA4Ig联合应用时,前者会对后者的作用产     

人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究

目的：通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体。研究其生物学活性，并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法：通过基因重组技术，将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中，然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组，经过293细胞包装，构建CTLA4Ig腺病毒载体，用RT-PCR，SDS-PAGE及Western blot等技术，检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌，通过体外实验，观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应（MLR）的抑制作用，通过大鼠体内实验，检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后，CTLA4Ig在体内的表达及分泌，通过体外实验，观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应（MLR）的抑制作用，通过大鼠体内实验，检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后，CTLA4Ig在体内的表达。结果：CTLA4Ig腺病毒载体构建成功，体外实验证实，CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液，能够抑制异基因脾细胞的单向MLR，体内实验表明，经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体，能够诱导移植耐受，延长心脏移植物的存活。结论：构建的CTLA4Ig腺病毒载体，体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白，该蛋白可抑制T细胞的活化，CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。     

CTLA4Ig对丝裂原诱导的淋巴细胞反应的影响

本研究证明CTLA4Ig 与B7 分子结合后, 可以阻断B7 与CD28 的结合。CTLA4Ig 可以抑制丝裂原所触发淋巴细胞的增殖反应, 同时抑制细胞因子IL 2 ,IL 4 的产生以及IL 2R 的表达。表明CTLA4Ig 可以通过不同的途径影响T淋巴细胞的活化     

CTLA_4Ig抑制T细胞增殖的体外研究

目的观察 CTL A4Ig在人外周血 T细胞增殖反应中的作用。方法植物血凝素 (PHA )、脂多糖 (L PS)、金葡菌肠毒素 B(SEB)刺激 T细胞增殖 ,在加入或未加入 CTL A4Ig情况下 ,观察细胞形态并检测 3H- Td R掺入量。结果 CTL A4Ig对PHA、L PS的抑制作用呈剂量依赖关系 ;而 CTL A4Ig浓度只有高于 5μg/ m L时 ,对 SEB才有抑制作用 ,且可完全抑制。结论CTL A4Ig对 PHA、L PS、SEB刺激下的 T细胞增殖反应有明显的抑制作用 ,但反应模式不一致。     

CTLA4-Ig在树突状细胞中的表达及效应研究

目的 获得CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,分析表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响。方法 采用脂质体转染方法将CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,通过ELISA法鉴定转染DC细胞48和72h培养上清液及稳定表达的培养上清液,分离Balb/c小鼠和C57BL/10J小鼠淋巴细胞为反应细胞和刺激细胞,观察CTLA4-Ig对同种细胞混合培养反应的影响。结果 将鼠CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,获得瞬时表达及稳定表达,CTLA4-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应,且效应亦呈剂量依赖性。结论 鼠CTLA4-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,其抑制作用随表达载体转染细胞培养上清液的增加而增强。同时获得了稳定表达CTLA4-Ig融合蛋白的CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,为以后的工作奠定了基础。     

CTLA4Ig基因修饰BMSCs对异种胰岛移植排斥反应的影响

目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白( CTLA4Ig)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)在异种胰岛移植排斥反应中的作用.方法 构建携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,用其感染BMSCs并和人胰岛细胞移植到糖尿病大鼠肾包膜下,建立人-大鼠异种胰岛移植模型.观察胰岛移植后糖尿病大鼠血糖变化、生存情况以...     

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓间质干细胞体外抑制免疫应答的研究

目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI)转染大鼠MSC,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,流式细胞术、Westernblotting等方法检测目的蛋白CTLA4Ig在MSC中的表达。将转基因MSC加入混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应。结果:重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig对MSC的最大转染率为80.7%±4.7%,转基因MSC可检测到目的蛋白的表达。基因修饰的MSC能有效抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,4d达到最大抑制效率51.46％;再次MLR证实这种抑制作用是供者特异性的。结论:MSC是一种较理想的基因转移靶细胞,其表达的转基因产物CTLA4Ig可在体外特异性地抑制免疫应答。     

Belatacept/CTLA4Ig: an update and critical appraisal of preclinical and clinical results

Introduction: The B7/CD28/CTLA4 signaling cascade is the most thoroughly studied costimulatory pathway and blockade with CTLA4Ig (abatacept) or its derivative belatacept has emerged as a valuable option for pharmacologic immune modulation. Several clinical studies have ultimately led to the approval of belatacept for immunosuppression in kidney transplant recipients.

Areas covered: This review will discuss the immunological background of costimulation blockade and recent preclinical data and clinical results of CTLA4Ig/belatacept.

Expert commentary: The development of belatacept is a major advance in clinical transplantation. However, in spite of promising results in preclinical and clinical trials, clinical use remains limited at present, in part due to increased rates of acute rejection. Recent efforts showing encouraging progress in refining such protocols might be a step toward harnessing the full potential of costimulation blockade-based immunosuppression.