小麦高分子量谷蛋白亚基基因片段的体外扩增

生物体尤其是高等动植物,绝大多数基因的拷贝数是很低的,如果没有基因扩增的手段,几乎无法研究基因的结构及其与表达的关系。当今分子生物学发展中最基本的技术之一基因克隆,实际上就是基因体内扩增(in vivo amplification)的技术。近年来发展了一种基因体外扩增(in vitro amplification)的新技术,又称     

小麦高分子量谷蛋白亚基Glu-B1位点沉默基因的克隆与序列分析

二粒小麦（Triticum turgidum L．var．dicoccoides）具有极其丰富的遗传多样性,是栽培小麦品种改良的巨大基因库。在高分子量谷蛋白基因的组成上,它具有许多栽培小麦不存在的变异类型,在Glu—B1位点上的变异更大。我们利用种子贮藏蛋白的SDS—PAGE方法从原产于伊朗的二粒小麦材料PI94640中观察到缺失Glu—B1区的高分子量谷蛋白亚基。利用Glu-1Bx基因保守序列设计PCR引物,对该材料的总DNA扩增,获得了X型亚基编码基因（Glu-1Bxm）的全序列,其全长为3442bp含1070bp的启动子区。序列比较发现,Glu-1Bxm在启动子区序列与Glu—1Bx7的最为相似。而在基因编码区,我们发现Glu—1Bxm仅编码212个氨基酸,由于开放阅读框中起始密码子后第637位核苷酸发生了点突变,即编码谷酰胺的CAA突变为终止密码TAA,可能直接导致了该高分子量谷蛋白亚基的失活,这是我们在小麦Glu—B1位点基因沉默分子证据的首次报道。将Glu—1Bxm全序列与Glu—B1位点其他等位基因进行了系统树分析,发现Glu—1Bxm是较为古老的类型。本文还对该特异高分子量谷蛋白亚基变异类型对品质遗传改良研究的意义进行了讨论。     

小麦高分子量谷蛋白亚基及其基因的研究进展

主要介绍了小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW－GS）及其基因的研究进展情况,目前,转基因小麦的技术已经逐渐成熟,由于分子生物学领域分子标记技术的迅速发展,尤其是PCR技术的广泛应用,为实现外源优良储藏蛋白基因导入改良品种提供了可能,利用已知小麦品种的基因序列设计引物,从众多的未知小麦品种中扩增出新基因加以研究并做外源优质HMW－GS基因的转入已成为一种趋势。     

四川小麦地方品种AS1643中低分子量谷蛋白基因的克隆及其蛋白质的二级结构预测

根据小麦低分子量谷蛋白基因保守区序列设计引物P1/P2, 采用PCR法对四川小麦地方品种AS1643的基因组DNA进行扩增, 获得1条约900 bp的片段, 分离、纯化后连接到载体pMD18-T上, 对筛选阳性克隆测序, 获得1个低分子量谷蛋白基因LMW-AS1643(GenBank登录号: EF190322), 其编码区长度为909 bp, 可编码302个氨基酸残基组成的成熟蛋白。序列分析结果表明, LMW-AS1643具有典型的低分子量谷蛋白基因的基本结构, 其推导氨基酸序列与其它已知的LMW-GS相比, 最高相似性为93.40%。生物信息学分析表明, 在LMW-AS1643低分子量谷蛋白中, 无规则卷曲含量最高, 为67.90 %, 其次是a-螺旋, 占30.46 %, b-折叠含量最少, 为1.64 %。     

小麦高分子量谷蛋白基因转录调控相关的顺反式相互作用的初步研究

利用凝胶延滞（ｇｅｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）分析技术, 研究了小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ）高分子量谷蛋白基因转录启始点上游９００ ｂｐ 的ＤＮＡ 片段与未成熟小麦胚乳细胞核因子的顺反式相互作用。利用ＤＮＡ聚合酶链反应技术, 将９００ ｂｐ 分成４ 段凝胶延滞分析用探针, 并以高盐浓度抽提法从扬花１２ ｄ 左右的小麦胚乳得到了核抽提物。凝胶延滞分析结果表明, 这４ 个ＤＮＡ片段上均存在与各自核蛋白因子专一性结合的位点。推测该基因的表达是受多位点复杂的顺反式相互作用来调控的     

一个小麦低分子量谷蛋白基因的分离

以新疆小麦日喀则基因组DNA为模板,采用Glu-D3位点特异引物进行PCR扩增。PCR产物插入pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌E．coli DH5a,获得阳性克隆。经测序发现该插入片段长度1287bp,包括了部分启动子序列和完整的编码序列。编码序列推导的蛋白质含有8个半胱氨酸残基,属于6类LMW-GS中的TypeI类,为以后这类基因的功能研究提供了基因材料。     

小麦新品种“川麦42”低分子量谷蛋白亚基新基因的分子克隆

采用PCR方法从小麦（Triticum aestivum L.）新品种“川麦42”中克隆得到一个低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）新基因,暂命名为LMWCM42-1。该基因编码区全长846 bp,编码281个氨基酸,具有LMW-GS基因的典型结构特征。推导氨基酸序列比较显示,尽管LMWCM42-1与已知LMW-GS高度相似,但在N-末端重复区部分重复单元和C-末端区中仍存在明显差异。聚类分析表明,LMWCM42-1可能是由Glu-D3位点编码的。     

部分小麦育种材料低分子量谷蛋白亚基等位基因变异

改进小麦LMW-G S分离技术,利用改良一步单向连续梯度SDS-PAGE技术分析40份具有较好品质、产量特性的小麦育种亲本材料的LMW-G S类型和组成形式。结果表明:采用适当的方法提取谷蛋白亚基,在4.8%浓缩胶(pH 6.8,C=2.6%),12.0%~14.0%连续梯度分离胶浓度(pH 8.8,C=1.3%),电流35 mA,电泳330 m in后可以获得良好的LMW-G S分离效果。G lu-3位点出现11种变异类型、19种亚基组合形式。G lu-A 3位点出现G lu-A 3a、G lu-A 3b、G lu-A 3c、G lu-A 3d 4种类型,频率分别为40.0%、12.5%、10.0%、37.5%;G lu-B 3位点出现7种亚基类型,其中G lu-B 3d、G lu-B 3b、G lu-B 3 j为主要类型,频率分别为40.0%、20.0%、12.5%。亚基组合形式G lu-A 3a G lu-B 3d组合频率最高,频率为22.5%;9个亚基组合分别只在一个亲本出现,占分析材料总数22.5%。G lu-A 3位点的遗传变异指数为0.673 8,G lu-B 3位点的遗传变异指数为0.800 8,表明G lu-3位点遗传变异丰富。     

部分小麦高分子量谷蛋白亚基组成分析

利用十二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析了85个小麦材料的高分子量谷蛋白亚基的构成,其结果表明：（1）目前生产中应用的优质小麦品种,大部分具有1A上的优质亚基1,1B上的14＋15／17＋18或1D上的5＋10,个别品种还同时聚合有1A,1B,1D上的优质亚基;（2）在所分析的28个八倍体小偃麦中,多数材料含有1,2^*和5＋10等优质亚基;（3）在本实验室创造的材料中,来源于中间偃麦草和普通小麦杂交的后代材料中大部分具有14＋15亚基。此外,个别种质材料还含有Payne亚基命名系统中未命名的一些稀有的高分子量谷蛋白亚基。     

小麦高分子量谷蛋白亚基效应的比较研究

采用SDS-PAGE方法,通过对5个亲本间杂交获得的F2群体每一单株的F3籽粒样本及其亲本进行小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）组成分析,并对每一F2单株上F3籽粒群体的高分子量谷蛋白亚基组成与其籽粒蛋白质含量、SDS-沉降值的关系进行研究,分析比较黄淮麦区出现频率较高的7个亚基或亚基对的品质效应。结果表明：小麦高分子量谷蛋白亚基组成不同群体间籽粒的蛋白质含量和SDS-沉降值基本达到显著或极显著水平。优质亚基表现为：1、7＋8、14＋15和5＋10亚基。因此,黄淮麦区小麦育种应加强对这些优质亚基的引入和利用,特别是对14＋15和5＋10亚基的引入和利用。     

小麦高分子量谷蛋白亚基对加工品质影响的效应分析

分析了 2 50份小麦材料的高分子量谷蛋白亚基 (HMW- GS)组成以及其中 66份材料的加工品质及面条制作品质。回归分析表明 :HMW- GS与 1 0种加工品质性状均有显著的线性关系。不同亚基对综合品质效应的得分大小依次为 :Glu- Al,1 >2 * >null;Glu- Bl,1 4 +1 5>7+8>1 7+1 8>>7+9;Glu- Dl,5+1 0 >>2 +1 2 >4+1 2。不同基因位点对品质的贡献大小顺序为 :Glu- Dl>Glu- Al>Glu- Bl。首次提出了 HMW- GS综合品质评分系统     

甘肃省春小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对甘肃省121个普通小麦品种(包括地方品种、育成品种和引进品种)高分子量谷蛋白亚基构成、不同等位基因间亚基变异及出现频率系统分析的结果表明,甘肃省春小麦品种HMW-GS等位基因Glu-Al编码1、2*、N(缺失)三种亚基,Glu-B1 编码 7 8、7 9、17 18、22、7、8、14 15七种亚基,Glu-D1编码2 12、2 11、5 10、2 10、10、4 11、3 12、N八种亚基,频率最高的亚基分别是Null(81.0%)、7 8(86.0%)、2 12(60.0%);一些优质亚基在现有品种中都存在,如甘春20、高台紫麦子等,作亲本用于品质改良有很大潜力,而且少数罕见亚基7、8、11也存在;不同来源的春小麦品种HMW-GS组成比较,优质亚基组成类型如1、7 8、5 10,1、17 18、5 10在育成品种中出现频率较高.     

类大麦材料y型高分子量谷蛋白基因不表达的鉴定

利用SDS-PAGE检测了2份类大麦属植物的高分子量谷蛋白亚基组成,在小麦的高分子量区域仅检测到1条蛋白带,因此怀疑其y型亚基没有表达.根据其它高分子量谷蛋白提取方法的结果以及基因编码区部分序列测定,确认其y型高分子量谷蛋白基因是沉默的.     

Tα1小麦轮选群体高分子量谷蛋白亚基组成分析

利用了Tα1小麦(Ms2)创建改良小麦面包品质的优质群体,采用SDS—PAGE法对其2次互交轮回群C2的HMW—GS组成进行了分析。结果表明：在供试的193个样品中各HMW—GS及其组成模式的频率不尽相同,Glu—A1、Glu—Bl和Glu—Dl位点上产生频率最高的亚基分别是1、14 15和2 12,各为54．40％、35．75％和60．10％,优质亚基5 10的频率为17．6％;“null、14 15、2 12”模式产生频率最高,为13．47％,并有“14 15,5 10”的优质亚基聚合体出现,占5．2％;该群体也产生了亲本不具有的13、16、22亚基及19种新的HMW—GS组成模式。说明利用Tα1小麦轮回选择技术是创造新亚基类型的一个有效途径。     

Ta1小麦轮选群体高分子量谷蛋白亚基组成分析

利用Ta1小麦 Ms2 创建改良小麦面包品质的优质群体,采用SDS-PAGE法对其2次互交轮回群体C2的HMW-GS组成进行了分析.结果表明:在供试的193个样品中各HMW-GS及其组成模式的频率不尽相同,Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点上产生频率最高的亚基分别是1、14+15和2+12,各为54.40%、35.75%和60.10%,优质亚基5+10的频率为17.6%; null、14+15、2+12 模式产生频率最高,为13.47%,并有 14+15,5+10 的优质亚基聚合体出现,占5.2%;该群体也产生了亲本不具有的13、16、22亚基及19种新的HMW-GS组成模式.说明利用Ta1小麦轮回选择技术是创造新亚基类型的一个有效途径.     

小麦Glu-B3位点LMW-GS基因的克隆及序列分析

以小麦特殊遗传材料———六倍体普通小麦阿勃二体、1A缺体、1B缺体和1D缺体,四倍体硬粒小麦墨西粒卡以及二倍体节节麦的总基因组DNA为模板,对D Ovidio等曾报道的硬粒小麦Glu-B3位点LMW-GS基因特异引物对P1(5-′tcctgagaagtgcatgacatg-3′)和P2(5-′gtaggcaccaactccggtgc-3′)进行了PCR扩增验证.结果表明,该引物对同样能特异扩增普通小麦Glu-B3位点LMW-GS基因.利用这对引物通过AS-PCR方法克隆得到优良小麦品种小偃6号1B染色体1个LMW-GS基因片段.该基因全长为1 089 bp,包含了完整的编码区和其上游318 bp的胚乳特异表达启动子区.该基因被命名为XY-Glu-B3-LMW2(GenBank登录号为DQ630442).XY-Glu-B3-LMW2的推测蛋白含256个氨基酸(包括N-端20个氨基酸的信号肽),其成熟蛋白有8个保守的Cys残基,均分布在C-末端区.XY-Glu-B3-LMW2是从小偃6号克隆到的第2个LMW-GS基因.     

外源1Dx5基因导致小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达变异

目的:为了结合基因枪转化和传统杂交方法培育优质小麦品种,对转基因小麦和国内主栽小麦品种杂交后代外源基因遗传表达行为进行了研究。方法:采用SDS-PAGE对2个小麦杂交组合川89-107×B72-8-11b和鄂麦18×B72-8-11b的杂交及回交后代籽粒进行高分子量麦谷蛋白亚基遗传表达分析。结果:在亲本中能够稳定超量表达的外源基因1Dx5在杂交后代中出现了不同的表达量,而且在外源基因的影响下,杂交后代出现了新的、杂交亲本并不表达的高分子量麦谷蛋白亚基。结论:多拷贝的外源基因在不同于受体环境的细胞质中的表达发生了变化,且由于外源基因的插入引起了内源高分子量麦谷蛋白亚基组成的变异。