不同引物介导的聚合酶链反应对人乳头瘤病毒的快速检测与分型

目的 比较通用引物、型特异性引物在检测人乳头瘤病毒（HPV）DNA中的应用。方法 104例尖锐湿疣组织中提取DNA后分别用HPV6b、11、16、18型特异性引物及通用引物MY09／11、GP5^＋／6^＋经聚合酶链反应（PCR）进行扩增。部分标本采用限制性内切酶Pst I来确定HPV11型。结果 GP5^＋／6^＋的检出率高于MY09／11，但差异无显著性（χ^2=3．78，P〉0．05）。GP5^＋／6^＋检出微量HPV DNA的敏感度高于MY09／11。型特异性引物检测HPV感染优于通用引物MY09／11结合酶切分型。结论 型特异性引物检出HPV11单一型感染显著多于HPV6b型，且发现HPV6b、11型同时感染有逐年增高之趋势。GP5^＋／6^＋引物结合型特异性引物可为临床上检测尖锐湿疣HPV型别提供方便易行的选择。     

聚合酶链反应反向点杂交法鉴定人乳头瘤病毒型别

为了探讨人乳头瘤病毒 (ＨＰＶ)的分型方法 ,我们将聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术和Ｓａｉｋｉ等[1] 提出的反向点杂交 (ＲＤＢ)技术结合起来 ,对ＨＰＶ进行型别鉴定 ,现报告如下。一、材料及方法1.标本来源 :30份宫颈癌组织标本 ,选自贵阳医学院附属医院病理科 ,为 1995年 1月～ 1997年 12月部分存档活检及手术切除的蜡块标本。2 .菌种及试剂 :内含ＨＰＶ全基因组的 4种ＰＵＣ19质粒 :ＨＰＶ6Ｂ、11、16和 18及特异性寡核苷酸探针 (ＳＳＯ) ,通用引物序列为 :ＧＰ5 5′ ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣ 3′ ,ＧＰ6 5′ ＧＡＡＡＡＡＴＡ…     

聚合酶链反应对尖锐湿疣组织中HPV分型检测的意义

聚合酶链反应对尖锐湿疣组织中ＨＰＶ分型检测的意义吕火祥钱奕红刘建栋（浙江省人民医院，杭州３１００１４）人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）６、１１、１６、１８型常引起人类生殖器感染，其中ＨＰＶ１６、１８型具有潜在的致癌性。国内外对ＨＰＶ的检测在尖锐湿疣组织中的型别...     

多重聚合酶链反应检测人子宫颈病毒感染

在同一反应体系中同时快速检测人子宫颈常见的人乳头状瘤病毒１６例、人疱疹病毒２型和巨细胞病毒以及沙眼衣原体感染。采用快速制备样品的方法简化了聚合酶链反应实验过程，应用多重聚合酶链反应检测四种病原体。     

达州市成年女性子宫颈HPV的感染现状及年龄分布状况研究

目的调查该地区成年女性子宫颈人乳头瘤病毒(HPV)的感染现状及感染的年龄分布情况,为该地区子宫颈癌的预防提供参考。方法选取2013年3月至2016年1月在该院妇产科门诊就诊的成年女性共计8 877名,分成6个年龄组。取子宫颈脱落细胞,进行聚合酶链反应(PCR)扩增和杂交洗膜显色,从而判断样本是否感染HPV病毒及感染何种HPV病毒;两两比较6个年龄组人群HPV感染率的不同。结果 8 877名成年女性中有1 778名感染HPV,总感染率为20.2%,其中中高危型HPV感染率16.04%,低危型HPV感染率2.95%。所有高危型HPV感染者中,HPV16为主要致病亚型;HPV58为第二致病亚型;低危型中HPV6为主要致病亚型。50~60岁组HPV感染率最高,其次为20~30岁组。50~60岁组HPV感染率明显高于其他组,差异有统计学意义(P0.05);而小于20岁组、20~30岁组、30~40岁组、40~50岁组、≥60岁组间HPV感染率两两比较差异无统计学意义(P0.05)。结论达州市成年女性子宫颈HPV16为主要致病亚型,开展各型HPV检测对于HPV感染和子宫颈癌的诊断、治疗具有重要意义。     

聚合酶链反应检测尿内人巨细胞病毒

２７例尿标本同时采用超速离心法，酚氯仿法抽提法、及原尿直接法，然后分别用于人类巨细胞病毒的聚合酶链反应检测。其阳性检出率分别为８５．１９％，５１．８５％和４８．１５％。经配比资料统计学分析表明，超速离心处理的阳性检出率显善高于抽提法和直接法。实验表明，原尿直接法的假阴性十分明显；而酚氯仿抽提处理亦无实际应用价值。唯有超速离心处理法可显著地提高尿巨细胞病毒的检测敏感性。     

双温聚合酶链反应检测EB病毒

应用双温循环ＰＣＲ（聚合酶链反应）方法检测鼻咽癌石蜡包埋组织，活检或冰冻组织，患者鼻咽拭子或血液中的ＥＢ病毒（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ。模板ＤＮＡ制备方法简便，无需酚提取步骤，双温ＰＣＲ快速（约需１．５小时）、灵敏、目前已用于临床检验。     

聚合酶链反应检测口腔鳞癌及癌旁组织中人类乳头瘤病毒DNA

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测２６例口腔鳞癌及１５例癌旁组织中人类乳头瘤病毒（ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｏｍａＶｉｒｕｓ，ＨＰＶ）ＤＮＡ，口腔鳞癌组织阳性率７６９％（２０／２６），比癌旁组织阳性率２００％（３／１５）明显增高（Ｐ＜０００５），说明ＨＰＶ感染与口腔鳞癌的发生发展有关     

HLA—DQB1基因分型技术

报告了简便、快速的ＨＬＡ－ＤＱＢ１聚合酶链反应一序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）基因分型技术。比较了基因分型与血清学分型技术的结果，其中３３份标本中６份血清型结果（１８．２％）与基因型不吻合。还讨论了基因分型的意义     

小片段PCR产物对布鲁菌种属鉴定的研究

目的 应用小片段PCR产物对布鲁菌进行快速种属鉴定.方法 收集2008年1月至2009年6月在吉林省松原地区从92例布鲁菌病患者血液中分离出的布鲁菌13株,其中羊布鲁菌9株,牛布鲁菌2株,猪布鲁菌2株.根据布鲁菌属细菌重复插入序列IS711及羊布鲁菌、牛布鲁菌及猪布鲁菌种间特异性基因片段设计引物,对3株布鲁菌标准菌株及13株临床分离布鲁菌分别进行PCR反应,获得相应PCR产物.将PCR产物T-A克隆并进行测序分析.对布鲁菌标准菌株DNA模板进行稀释,对每一稀释度的DNA模板分别进行10次PCR扩增,进行灵敏度和稳定性检测.结果 4种PCR反应均可获得特异的小片段PCR产物,片段长度分别为63、67、81和83 bp,T-A克隆测序结果 与目的 基因片段比较,符合率为100%,检测模板的最低DNA浓度为1 μg/L,分别用不同的引物对相应布鲁菌DNA模板进行10次PCR扩增,均得到预期结果 .结论 本研究建立的PCR反应能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.     

应用生物发光技术定量检测PCR扩增产物

目的　建立一种基于生物发光技术的定量检测PCR产物的方法 ,并用于HBV定量PCR检测。方法　首先利用ATP硫酰化酶 (ATPsulfurylase)将焦磷酸 (PPi)定量转化成ATP ,然后利用虫荧光素酶 (luciferase)系统发光检测ATP ,从而确定样品中PPi含量。利用 2次PCR法扩增HBVDNA目的片段 ,并进行回收纯化定量 ,以之作为阳性标准模板制作标准曲线。选择适当的循环次数扩增样品中HBVDNA ,利用化学发光法检测扩增产物中PPi的量 ,进而确定样品中HBVDNA模板的量。结果　当起始模板量为 (10～ 5 )× 10 5拷贝 ,循环次数为 2 5 ,发光值与起始模板浓度呈现良好的相关。检测 32份样品血清 ,其中 2 3例HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中HBVDNA平均含量为 1 6× 10 5拷贝 / μl,9例HBsAg(+)、HBeAg(- )、HBcAb(+)标本中HBVDNA平均含量为 5 6× 10 3 拷贝 / μl。结论　本方法是一种操作简便、灵敏度高的定量PCR方法     

人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）型别鉴定。方法利用ＨＰＶ通用引物介导ＰＣＲ（ＧＰＰＣＲ）扩增靶ＤＮＡ，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰＰＥＩＱＩ），与预先包被在微孔板上的ＨＰＶ寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果ＨＰＶ各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达１３～７６个病毒ＤＮＡ拷贝，比ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测高１０倍；该法重复性好，阳性孔批内ＣＶ为６．３４％，批间ＣＶ为１０．５３％，阴性孔批内ＣＶ为１％，批间ＣＶ为５．７９％；而且杂交影响因素较少。结论该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和ＥＢ染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。     

SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12

目的 建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法，对1份已知HLA—DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA—DRB1*12位点检测和分型。结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析，有3份标本为DRB1*12，产物用离心柱纯化后，直接进行DNA测序，结果证实为DRB1*12阳性。结论 SYBR Green Ⅰ PCR操作简便，结果准确，可成为一种HLA基因分型的新方法。     

侵袭性烟曲霉菌感染早期诊断的实验研究

目的：探讨巢式聚合酶链反应(PCR)方法和曲霉菌半乳甘露聚糖抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法早期诊断侵袭性曲霉菌感染的可行性和临床应用价值。方法：(1)建立侵袭性曲霉菌感染的动物模型，收集不同时期实验动物的血样及各脏器标本，进行巢式PCR方法的检测。(2)对临床确诊或拟诊的侵袭性曲霉菌感染患者的血液标本进行巢式PCR方法的检测；对血清标本进行曲霉菌半乳甘露聚糖抗原nISA方法的检测。结果：(1)动物实验中，巢式PCR和血培养阳性率分别为77．8％和16．7％，两者差异具有显著意义；灵敏度和特异度分别为77．8％和：100％。(2)在临床确诊或拟诊的侵袭性曲霉菌感染患者的检测中巢式PCR方法的灵敏度和特异度分别为100％和83．3％；曲霉菌半乳甘露聚糖抗原ELISA检测的灵敏度和特异度分别为55．6％和88．2％。结论：巢式PCR方法具有良好的灵敏度和特异性，适用于临床早期诊断侵袭性曲霉菌感染。曲霉菌半乳甘露聚糖抗原ELISA检测可用于临床诊断侵袭性曲霉菌菌感染，有望辅助或替代传统方法。     

PCR扩增肠癌组织p53基因失败的原因分析与解决

分析与解决PCR扩增肠癌组织p53基因时失败的问题,为如何解决PCR技术在科研应用中的问题提供一个实例.方法 经初步分析,将失败原因确定为DNA模板有问题、采用下列方法处理模板再进行PCR反应：用70%乙醇再清洗模板、用新标本重新提取模板、用PCR反应成功与失败的模板配成混合模板.比较PCR成功与失败所用模板的差异,寻找与证实失败的原因.结果 最终发现溶解DNA模板的TE缓冲液浓度过高,使PCR扩增失败,排除之后获得成功.结论 当PCR扩增失败时,不妨从最简单的反应体系的离子环境先找原因.     

多重实时PCR检测高危型人乳头瘤病毒感染

目的 调查不同宫颈病变组妇女生殖道13种高危型HPV(HR HPV)感染情况,分析HR HPV感染与宫颈病变的关系.方法 选择深圳市宝安区妇幼保健院宫颈专科门诊患者350例,利用TCT技术检测其宫颈上皮细胞学状况,根据细胞学结果分组.采用多重实时PCR(mRT PCR)检测其生殖道HR HPV感染情况和病毒载量,采用χ2检验或Fisher精确概率法比较各组间HR HPV感染率,采用Kruskal-Wallis或Wilcoxon秩和检验比较各组间HR HPV阳性者的病毒载量,采用Wilcoxon秩和检验比较HR HPV阳性和阴性组的年龄分布情况.结果 未见上皮内病变或恶性病变(NILM)组、意义不明的非典型鳞状上皮细胞增生(ASCUS)组、鳞状上皮细胞低度病变(LSIL)组、鳞状上皮细胞高度病变(HSIL)组的HR HPV阳性例数分别为10例(3.4%)、7例(20.0%)、11例(78.6%)和6例(6/6).NILM组HR HPV阳性率低于ASCUS组、LSIL组,ASCUS组HR HPV阳性率低于LSIL组,差异有统计学意义(χ2值分别为14.43、107.69、14.76,P均<0.01);NILM组低于HSIL组、ASCUS组低于HSIL组,差异有统计学意义(P值分别为0.000 1、0.000 4).NILM组、ASCUS组、LSIL组和HSIL组HR HPV阳性者的病毒载量分别为4.10 (3.38～6.27)、5.33 (3.63～6.66)、5.77 (4.01～7.01)和5.58 (4.19～5.85)(拷贝/ml,lg).将ASCUS组、LSIL组和HSIL组3组合并为宫颈细胞异常组,病毒载量为5.58(3.63～7.01)(拷贝/ml,lg)高于NILM组,差异有统计学意义(U=43.0,P<0.05).HR HPV阳性组平均年龄36(21～56)岁,与阴性组[33(21～58)岁]比较,差异无统计学意义(U=4 544,P>0.05).结论 HR HPV感染与宫颈病变有关;HR HPV病毒载量高低与宫颈病变程度无相关性,但病毒载量越高,存在宫颈病变的可能性越大.HR HPV阳性组与阴性组的年龄分布无差异.

Abstract：

Objective To investigate 13 high-risk types of HPV (HR HPV) infection rates in women with different grades of cervical lesions.Methods A total of 350 women, who were hospitalized in the department of gynecology in Bao′an Maternity & Child health hospital, were enrolled for the study.TCT technology was used to evaluate the cervical epithelium.The group were divided according to the cytology results.Multiplex real time PCR (mRT PCR) was used to detect the viral loads.HR HPV infection rate of different groups were analyzed using χ2 test or Fisher exact test.HR HPV viral loads of patients in different grades of cervical lesion groups were compared using Kruskal-Wallis or Wilcoxon test, and the age distribution of HR HPV positive group and negative group was analyzed by using Wilcoxon test.Results The HR HPV infection rates of NILM, ASCUS, LSIL, HSIL were 3.4% (10/295), 20.0% (7/35), 78.6% (11/14) and 100.0% (6/6), respectively.HR HPV positivity in NILM was lower than ASCUS (χ2=14.43,P<0.01) and LSIL (χ2=107.69,P<0.01), HR HPV positivity in ASCUS was lower than LSIL (χ2=14.76,P<0.01). The median of HR HPV viral loads in NILM, ASCUS, LSIL and HSIL were 4.10 (3.38-6.27), 5.33 (3.63-6.66), 5.77 (4.01-7.01) and 5.58 (4.19-5.85) respectively (copies/ml,lg).Combined ASCUS, LSIL and HSIL groups into cervical lesion group, HR HPV viral load of which was higher than that of NILM (U=43.0, P<0.05).The median Ages of HR HPV positive group and negative group were 36 and 33, respectively.No statistical significance was found between them (U=4 544, P>0.05).Conclusions The present study revealed that HR HPV infection was related to cervical lesion, but there was no correlation between viral load and cervical lesion grade. In additional, no difference in age distribution was found between HR HPV positive group and negative group.     

聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌

目的　研究以非培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法　将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上;用氯化苄法提取念珠菌ＤＮＡ,采用真菌特异通用引物ＰＣＲ 扩增ＤＮＡ,在扩增过程中用Ｂｉｏ１１ｄＵＴＰ 标记扩增产物,然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果　对１４ 种念珠菌扩增均为阳性,对３ 种常见细菌扩增均为阴性。３ 种念珠菌只与其对应探针杂交。结论　该方法简便、快速、准确,适于临床实验室快速检测与鉴定念珠菌。     

Prevalence of sexually transmitted infections among healthy Korean women: Implications of multiplex PCR pathogen detection on antibiotic therapy

In this study, we investigated the prevalence of sexually transmitted infections (STIs) using multiplex real-time PCR assay in healthy Korean women. We also evaluated the risk factors of STIs, and compared the various factors between the STI-positive and the STI-negative groups.A total of 799 endocervical swab samples from healthy Korean women who visited our hospital for general medical check-ups during January 2012 to October 2012 were included. Eight STIs including Human papillomavirus (HPV), Chlamydia trachomatis (CT), Neisseria gonorrhoeae (NG), Mycoplasma genitalium (MG), Mycoplasma hominis (MH), Ureaplasma urealyticum (UU), Ureaplasma parvum (UP), and Trichomonas vaginalis (TV) were detected using Anyplex II STI-7 Detection assay Detection (Seegene, Seoul, Korea) and Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA test (Digene Corporation, Gaithersburg, MD, USA) according manufacture's protocols.Ninety-seven (12.1%) subjects were positive for HPV. Of 393 (49.2%) subjects were infected with at least one microorganism and a total of 499 STIs were identified. Among the 393 STI-positive subjects, the proportion of single, double and triple infection was 76.3%, 20.4% and 3.3%, respectively. The median age of the STI-positive group (47 years, range 42–52) was younger than the STI-negative group (49 years, range 43–56; P < 0.001). The infection rate of HPV was significantly higher in the STI-positive group (15.8%, 62/393) than the STI-negative group (8.6%, 35/406) (P = 0.002).