未开发油气田地表烃氧化菌空间定量分布

利用Real-time PCR技术,分别对非油气田对照区域、未开发油田、未开发气田地表30、60、100、150、200 cm深度的甲烷氧化菌、C5～C16烃氧化菌进行定量研究,目的在于加深对该类型区域烃氧化菌空间分布特征的了解,为微生物油气勘探技术的发展提供基础资料.结果表明,气田区域甲烷氧化菌(pmoA)含量为1.34E+04～3.90E+05 copies.g-1,并随深度的加深逐渐减少;油田仅为3.14E+02～4.32E+03 copies.g-1.100～200 cm深度,油田C5～C16烃氧化菌(alkB)含量为1.38E+07～3.61E+07 copies.g-1,高于等深度对照(4.24E+06～2.14E+07 copies.g-1)和气田区域(5.82E+06～3.52E+07copies.g-1).甲烷氧化菌分布受全氮、有机碳、pH影响显著,相关系数分别为0.859、0.631、-0.549,而C5～C16烃氧化菌分布受环境因素影响相对较小.100～200 cm深度范围内,该区域全氮、有机碳、pH等理化因素相对稳定,烃氧化菌含量在不同深度间差异较小.因此,本研究表明,气田区域具有明显的甲烷氧化菌异常,油田在100 cm以下深度具有一定的C5～C16烃氧化菌异常;100～200 cm更适于作为统一取样深度进行大范围定量调查,但仍需要进一步的验证.     

采油废水处理系统活性污泥中可培养菌群多样性研究

采用6种不同培养基从采油废水处理系统活污泥中分离纯化得到200株菌,经16S rRNA基因序列系统发育分析表明,所分离菌株分属于5个大的系统发育类群的23个属的39个种。其中,α-变形菌纲占2.5%,β-变形菌纲占2.5%,γ-变形菌纲占49.5%,厚壁门占27.5%,放线菌门占18%。其中不动杆菌属是系统中可培养的最优势菌属。经物种多样性分析表明,所分离菌群Shannon多样性指数为3.13,均匀度指数为0.85。结果显示本系统具有较丰富的系统发育、遗传和物种多样性。代表菌株石油降解效果分析表明,不动杆菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、草分支杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、产气单胞菌和硝酸盐还原菌属均对采油废水中石油类污染物具有不同程度的降解作用,其石油降解率均在30%以上,最高可达84.8%。     

自然土壤中苯酚降解菌的分离和系统发育分析

采用富集培养的方法,从未受苯酚污染的自然土壤中分离得到5株能以苯酚为唯一碳源生长的细菌.根据生理生化特性和系统发育分析对它们进行了初步鉴定,菌株PHD-2为Ralstonia sp.,菌株 PHD-4为Acinetobacter sp.,菌株PHD-5 为Microbacterium sp.,菌株PHD-1和PHD-3均为Pseudomonas sp.,16S rRNA基因序列的同源性比较和系统发育分析表明自然土壤中的苯酚降解菌具有丰富的多样性.     

酸性矿山废水库周边土壤微生物多样性及氨氧化菌群落研究

采集了安徽某铁矿酸性矿山废水库周边土壤样品,测定其理化参数,并采用分子生物学方法分别研究了土壤中细菌和古菌群落组成以及驱动氨氧化作用的微生物类群.结果表明,该土壤样品受到酸性矿山废水严重污染,pH低于3,铁铝等金属含量很高.细菌的16S rRNA基因文库覆盖11个类群,其中酸杆菌门(Acidobacteria)占主导地位,丰度达47.4%;疣微菌门(Verrucomicrobia)为第二大门类,丰度为18.9%.样品中含有大量嗜酸的细菌类群,如Candidatus Koribacter versatilis和Holophaga sp.等.古菌的16S rRNA基因文库仅覆盖2个类群,分别为奇古菌门(Thaumarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota),奇古菌门占绝对优势地位.该土壤样品中的氨氧化作用可能主要由奇古菌门的氨氧化古菌所驱动,且该区域存在新的氨氧化古菌类群.     

生活垃圾填埋操作方式对覆土中Ⅰ型甲烷氧化菌的影响研究

填埋场覆土中的甲烷氧化菌可削弱填埋场的温室气体释放,其中I型甲烷氧化菌对环境条件的改变反应灵敏.实验采用16S rDNA特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)基因指纹技术研究不同填埋操作方式,包括高密度聚乙烯膜(high-density polyethylene liner,HDPE)隔离、渗滤液亚表面灌溉和植被种植,对城市生活垃圾填埋场表层覆土中I型甲烷氧化菌的群落结构和多样性的影响.16S rDNA序列的系统发育分析结果表明,供试土壤中的I型甲烷氧化菌均属于甲基杆菌属(Methylobacter).从香农-威纳多样性指数(Shannon-Wiener diversity index)和主成分分析的结果可以归纳得到:渗滤液亚表面灌溉和植被种植比HDPE膜隔离对表层覆土中I型甲烷氧化菌群落结构的影响更大,它们会降低I型甲烷氧化菌的多样性,并且推测渗滤液亚表面灌溉会抑制Methylobacter的生长.无HDPE膜隔离的土壤中,即有填埋气体侵入的土壤中,随填埋气体作用于土壤时间的延长,I型甲烷氧化菌的群落结构会发生变化;覆土时间分别为3周、1.5 a和5 a的土壤中,I型甲烷氧化菌的香农.威纳多样性指数在覆土1.5a时达到最大值.     

植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序中降低宿主污染的方法

植物内生菌能够帮助植物生长,增强其抗逆性与抗病性,研究植物内生菌对了解植物入侵机制、保护生态环境与农业的健康发展具有重要意义.通过阅读相关文献,总结归纳了降低植物内生菌16SrRNA基因扩增子高通量测序(16S-seq)中宿主基因污染的4种方法,即:①寻找特异性错配引物用来扩增细菌16S rRNA基因;②添加特异性阻断...     

SO2诱导驯化城市污水处理厂氧化沟微生物的多样性分析

对城市污水处理厂氧化沟采集的微生物用低浓度SO2诱导驯化6d以上可培养出脱SO2微生物种群,它们之间相互协同,共同行使着对溶于水中的SO2生化降解的生物学功能,对SO2的生化降解速率高达888mg·（L·h）^-1,1．5h水中的SO3^2-的降解效率〉85％．脱硫菌样品经DNA提取及16SrRNA基因片段的聚合酶链反...     

抚顺西露天油页岩可培养微生物的分离与鉴定

为了解油页岩中可培养微生物的多样性,利用稀释平板培养法对我国抚顺盆地西露天组油页岩中可培养微生物进行分离纯化,并对所获菌株进行16S rDNA(细菌)和rDNA ITS(真菌)序列测定和系统发育树分析.以营养琼脂培养基分离到8株细菌,以马铃薯葡萄糖琼脂培养基分离到4株真菌.16S rDNA序列测定结果表明细菌菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus),赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus),短杆菌属(Brevibacillus),类芽胞杆菌属(Paenibacillus)和红球菌属(Rhodococcus); rDNA ITS序列测定结果显示真菌菌株分别属于芽枝霉属(Cladosporium),曲霉属(Aspergillus),犁头霉属(Absidia)和正青霉属(Eupenicillium). 2株细菌(ZK4和ZK5)能够在以油页岩为唯一碳源和氮源的固体培养基上连续生长5代以上,且长势良好, 可作为油页岩生物转化的潜力菌株进行深入研究.     

一种未见报道的厌氧氨氧化菌分子生物学鉴定

以（NH4）2SO4和NaNO2作为基质,富集厌氧氨氧化污泥。提取厌氧氨氧化污泥中细菌总DNA,纯化后使用特异性引物对厌氧氨氧化菌16SrDNA进行PCR扩增。扩增产物连接到pMD19-T载体,将载体转化到感受态细胞大肠杆菌JM109中,并对其16SrDNA基因进行测序。将测序结果进行系统发育树分析,发现富集得到的厌氧氨氧化菌与Candidatus Anammoxoglobus propionicus进化关系比较接近,是一种尚未见报道的厌氧氨氧化菌。     

厌氧氨氧化菌富集培养过程微生物群落结构及多样性

为深入理解厌氧氨氧化菌富集培养过程微生物群落变化特征,采用ASBR反应器进行厌氧氨氧化菌富集培养,考察了不同培养时间微生物群落组成、多样性及物种网络关系.结果表明,通过逐步提高基质浓度,实现了厌氧氨氧化菌富集,NH₄⁺-N和NO₂^--N去除率分别为97.6%和95.4%,总氮去除率为84.9%.高通量测序发现,整个培养过程优势菌门(相对丰度> 5%)为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和放线菌门(Actinobacteria);富集培养获得的主要厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadia,相对丰度从1.42%增长到24.66%;培养过程,微生物群落优势菌群组成未发生变化,但相对丰度呈现显著差异(P <0.05).富集培养过程不同时间,微生物群落α多样性呈现先升高后降低的趋势,且存在显著差异(P <0.05)...     

海洋油气田沉积物产甲烷活性及微生物生态

海洋产甲烷古菌是与海洋中甲烷的产生、释放及天然气水合物的形成等密切相关的微生物类群.以产甲烷菌可能利用的底物为碳源,评价了海洋油气田沉积物的产甲烷活性.结果表明,海洋油气田沉积物对于H2/CO2、甲醇、一甲胺、三甲胺,在25℃和37℃两种温度条件下都具有较高的产甲烷活性,少数样品只在37℃对乙酸有产甲烷活性,说明在海洋油气田环境下,主要有氢营养型及甲基营养型发酵途径产生天然气甲烷.利用厌氧培养法对产甲烷菌进行了多样性解析,16S rRNA基因测序显示,优势产甲烷菌主要属于Methanosarcinales目的 Methanosarcinaceae科及Methanomicrobiales目的 Methanomicrobiaceae科,其中Methanococcoides、Methanogenium和Methanosarcina为油气田沉积物的主要菌属.     

石油集输系统中硫酸盐还原菌的分布和多样性

分别用亚甲蓝比色法、MPN法和16S rRNA基因序列分析方法,研究中国长庆油田(陕北)石油集输系统中原油和水样中H2 S的分布以及硫酸盐还原菌(SRB)的分布和多样性.结果表明,从油井井口经石油计量站再到石油综合处理站的集输系统中,原油中H2S的含量依次为105.80、99.70、24.57 mg.L-1;SRB的数量依次为98、300、680 CFU.100 mL-1.水样中H2S的含量依次为1.13、2.80、3.49 mg.L-1;SRB的数量依次为9 500、40 000、76 000 CFU.100 mL-1.集输系统中水样中SRB的数量平均为原油样品的100倍以上.原油井口中高浓度的H2S抑制了SRB的生长,SRB数量较少;随着H2S浓度的降低,抑制作用削弱并消失,使集输系统中SRB的数量逐渐增加.水样中H2S初始浓度较低,SRB数量较多,系统中H2S的含量随着SRB数量的增大而逐渐增多.由16S rRNA基因的序列分析表明,能够同时在水样和原油样本中检测到与脱硫弧菌属(Desulfovibrionaceae sp.)以及脱硫球菌属(Desulfococcus sp.)相关的SRB基因序列.但是,在水样中能够检测到与脱硫念球菌属(Desulfomonile sp.)、脱硫弯杆菌属(Desulfotomaculum sp.)和脱硫八叠球菌属(Desulfosarcina sp.)相关的SRB基因序列,而在原油样本中未检测到.在石油集输过程中由于环境条件的变化,水样和原油样品中SRB的多样性都有一定的增加.     

玉门油田污染荒漠土壤石油降解菌多样性

为探索石油污染荒漠土壤石油降解微生物多样性、筛选高效石油降解菌,采用涂布平板法从石油污染荒漠土壤分离具有石油降解能力细菌,采用细菌形态观察和16S rRNA基因序列分析其多样性,并设计特异性引物,对分离细菌降解相关基因进行检测.结果表明,分离的37株细菌分别属于放线菌纲(Actinobacteria)、γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β变形菌纲(Betaproteobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和α变形菌纲(Alphaproteobacteria),分别占35.14%、32.43%、13.51%、13.51%、5.41%,归属于21个属的34个种类.优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)和葡萄球菌属(Staphylococcus),占总数的51.35%,其中有36株细菌能以石油为唯一碳源稳定生长,对原油有明显的降解能力.在石油质量浓度为1 500 mg/L的基础培养基中,菌株YM43在培养7 d后对石油的降解率达55.47%,另有8株细菌的降解率不低于30.55%,11株细菌的降解率介于10.05%~28.37%,18株细菌的降解率不高于8.05%. PCR检测表明,有25株细菌含有烷烃单加氧酶基因,6株含芳烃双加氧酶基因,6株含联苯双加氧酶基因,4株含萘双加氧酶基因,3株含甲苯双加氧酶基因,2株含邻苯二酚双加氧酶基因.研究显示,石油污染荒漠土壤中可培养细菌具有高度多样性,分离的菌株有较强的石油降解能力,其降解功能与所存在的降解基因有关.      

利用PCR-DGGE分析未开发油气田地表微生物群落结构

利用PCR-DGGE和克隆测序技术,分别对未开发油田、气田和非油气田对照区域,地表30、60、100、150、200 cm深度的土壤微生物分布进行研究,目的在于了解未开发油气田区域土壤微生物的分布特征,寻找潜在的油气资源指示菌.结果表明,不同深度土壤样品间的菌群相似度很低(26～69.9).在150 cm和200 cm处,DGGE图谱具有更好的丰富度(≥19)、多样性(≥2.69)和均匀度(≥0.90).油田区域富含γ-Proteobacteria(75%),此外还包括α-Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria,其相似菌株主要为石油相关菌和烃降解菌,如食烷菌、噬甲基菌.气田含有α、β、γ、δ-Proteobacteria和Bacteroidetes,γ-Proteobacteria含量较小(24%),所获16S rDNA条带相似菌株大多不具有烃降解能力,部分具有甲烷相关性,如甲基孢囊菌.在此类研究中,150 cm、200 cm更适于作为统一取样深度进行大范围取样调查;甲基孢囊菌可用来作为潜在的气田指示菌,食烷菌和噬甲基菌可作为潜在的油田指示菌,但仍需进一步地大范围取样验证.     

鄱阳湖水体细菌群落组成及遗传多样性

利用建立细菌16S rRNA基因文库和限制性内切酶长度多态性(RFLP)分析的方法,对鄱阳湖南、北湖区水体的细菌多样性进行了研究. 结果表明,鄱阳湖水体细菌多样性较高,且南湖区2007年水体的细菌多样性明显高于其2006年水体和北湖区水体. 主要细菌组成分析表明,鄱阳湖水体中的349个阳性克隆代表的167种基因型分别属于十大细菌类群,变形菌门(Proteobacteria)在4个克隆文库中占据了47%～81%,数量极其丰富,尤其是亚型的β-变形菌为优势菌群; 拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)也广泛分布,且有2.9%～17.1%的克隆数属于未分类细菌. 研究结果进一步提示鄱阳湖水体有一定程度的富营养化.      

九龙江流域潜在病原菌污染分析

近年来,由于流域经济快速发展和城镇化进程加快等原因,九龙江水污染问题日趋严重.为全面认识九龙江流域病原菌的分布状况,应用16S rRNA基因-454焦磷酸测序技术测定九龙江支流西溪、北溪水体和沉积物中细菌16S rRNA基因V1~V3高变区,共获得204 216条高质量序列.通过与病原菌参考数据库对比分析发现,九龙江分布有68个潜在病原菌属,占序列总量的6.1%.其中梭菌属(Clostridium)、分支杆菌属(Mycobacterium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在所有样品中都有检出,且丰度最高,分别占病原菌属序列总量的54.5%、5.9%和5.6%.在种水平上,九龙江分布有48种病原菌,占序列总量的0.76%.其中Afipia felis、Mycobacterium asiaticum、Clostridium baratii、Brucella melitensis和Delftia tsuruhatensis是丰度最高的5种病原菌,分别占病原菌种序列总量的48.9%、20.3%、8%、2.7%和1.7%.统计分析表明,九龙江水体中分布的病原菌种类数(属或种)显著高于沉积物中,且西溪水体检出的病原菌种类(属或种)和丰度最高,说明九龙江水体,尤其是西溪水体受病原菌污染的风险较高.此外,相关分析表明,九龙江水体中病原菌的种类数(属或种)和丰度与营养盐(氮、磷)有着显著的正相关关系,说明九龙江水体中分布的病原菌与沿岸的人类活动,如养殖业、污水排放等密切相关.因此,为保证流域的公共卫生安全,需进一步加强污染源清理整顿工作,开展水环境病原菌的实时监测.     

海洋沉积物中反硝化细菌的分离鉴定及反硝化性能研究

利用良好的通气条件对反硝化细菌进行富集筛选,同时利用二苯胺试剂和Griess试剂显色反应分别检测NO₃--N的降解和NO₂--N的产生情况,并结合产气量筛选出具有良好耐氧性且反硝化性能优异的菌株. 最终从南海海域沉积物中筛选得到具有较强反硝化能力的细菌,并对目的菌株进行分子鉴定及反硝化能力测试. 结果表明,目的菌株F-8-1能较好地降解培养基中的NO₃--N和NO₂--N,产气快. 气相色谱检测发现,气体样品中的φ(N₂)非常高,接近100%,且未检测出其他氮氧化物气体. 16S rDNA序列分析表明,菌株F-8-1与假单胞菌属具有99%的序列相似性和很高的同源性.菌株F-8-1在有氧及高盐环境中生长良好.      

A2O工艺活性污泥中可培养丝状细菌的多样性

活性污泥法是应用最广泛的污水处理方法之一,但是由于丝状菌过度繁殖而引发的污泥膨胀是制约其发展的重大难题.本研究从A2O工艺城市污水处理系统的膨胀期活性污泥中分离培养出17株丝状细菌.对各菌株进行了16S rDNA测序和系统发育树分析,结果表明,这些分离的可培养丝状细菌均属于链霉菌属;利用rep-PCR指纹图谱技术进一步分析了所得菌种属内多样性,显示出活性污泥中链霉菌存在丰富的多样性.由于这些可培养丝状细菌与引起污泥膨胀的优势丝状菌(微丝菌)生理特征差别较大,不会在污水处理系统中过度繁殖,本研究向活性污泥中投加一定量的链霉菌分离菌株,发现部分菌株对污泥的沉降性能有明显改善作用,为污泥膨胀的防控提供了新的思路.     

典型岩溶土壤微生物丰度与多样性及其对碳循环的指示意义

探讨土壤微生物指标的变化规律,用于揭示其在岩溶土壤碳循环中的指示意义.以桂林岩溶试验场洼地、坡地和垭口这3种岩溶地貌形态下的剖面(0~10、10~20、20~30cm)土壤为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCRDGGE)和荧光定量PCR相结合的方法,分析这个典型岩溶土壤剖面中的微生物多样性和丰度变化.数据显示,16S rRNA最高丰度出现在洼地,为1.32×1011拷贝·g-1,而18S rRNA最高丰度出现在垭口,为1.12×1010拷贝·g-1;洼地和垭口剖面的16S rRNA丰度随着深度的增加而降低,3种岩溶地貌形态的18S rRNA丰度均随着剖面深度的增加而降低,与土壤有机碳质量分数的变化趋势一致.但是,在3种岩溶地貌形态中,3个16S rRNA和6个18S rRNA的多样性指数均随土壤剖面深度的增加而增大.由于16S rRNA和18S rRNA的多样性与丰度和土壤有机碳之间总体上表现出相反的变化趋势,说明微生物丰度指标在土壤碳循环中的指示意义比微生物多样性指数更重要.     

上海大气降水中细菌气溶胶的多样性研究

采用分子生物学技术16S rRNA克隆文库方法,以上海市2012年不同月份的大气降水样品为模板构建细菌16S rRNA克隆文库,对连续5个月的大气降水样品中细菌群落结构组成及多样性进行了研究,并对其群落结构的生物多样性、物种丰度及覆盖率等进行了分析比较.结果表明,变形菌门(Proteobacteria)(α-,β-,γ-)是上海市降水样品中细菌的优势菌群(32.5%~94.1%),另外还包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、蓝藻门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)共7个主要门类的细菌,以及未定菌(TM7).多样性指数分析结果显示,不同月份降水样品的细菌群落结构组成与多样性均存在着差异性,夏季6月样品的细菌群落生物多样性及物种丰度明显高于其它样品,其次是秋季8月的样品.