X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4表达的影响

CD14是LPS/LBP复合物的受体,以LPS-LBP-CD14三联体形式介导LPS诱导细胞活化.TLR4是Toll样受体中发现较早的一个受体,是LPS信号跨入细胞所必需的跨膜受体[1].CD14和TLR4作为巨噬细胞膜上的跨膜受体将细胞外信号传到细胞内,通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子NF-κB和Jun/Fos,释放IL-1和IL-6等细胞因子而发生炎性反应.本研究探讨X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4表达的影响,为临床应用X射线进行抗炎、抗肿瘤治疗提供理论和实验依据.     

内毒素的跨膜信号转导及其在全身炎症反应综合征中的作用

失控性炎症反应是目前临床上最为常见的病理现象，是创伤后并发症发生发展的重要机制。细菌脂多糖（LPS）是最常见的诱导失控性炎症反应的主要因素之一。单核／巨噬细胞表面LPS相关受体是机体识别并启动炎症反应的始动因素，是诱导炎症反应失控的关键环节之一，单核／巨噬细胞膜表面存在多种LPS相关受体，其中清道夫受体（SR）、CD14、Toll样受体4（TLR4）为高亲和力或敏感性LPS受体。SR与单核／巨噬细胞清除、灭活LPS有关；CD14和TLR4是介导LPS激活细胞的重要受体。TLR2、β2整合素、L-selectin等为低亲和力LPS受体，作为“二级受体”在促进LPS诱导的促炎症和抗炎症反应中可能发挥重要的“催化作用”。TLR4可能是LPS激活血管内皮细胞的受体途径。单核／巨噬细胞表面防御性受体（如SR）下调、兴奋性受体（如CD14、TLR4、TLR2等）上调，可能是感染过程中单核／巨噬细胞由早期的防御性（清除、灭活LPS）转化为后期的效应性（释放大量的炎症和抗炎症介质）的重要机制。深化研究LPS跨膜信号转导的分子机制，可望为有效控制失控性炎症反应提供新思路。     

大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体2/4基因表达及受体反应性

目的 观察大鼠创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体(TLR)2/4基因表达及受体反应性变化.方法 建立大鼠严重创伤(右侧胸部撞击伤复合双侧股骨闭合性骨折)模型,分别于创伤后2、6、12、24小时取腹腔巨噬细胞,以逆转录-聚合酶联反应(RT-PcR)测定TLR2/4的mRNA表达,以脂多糖(LPS)、Pam3CSK4刺激后取细胞上清液测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.结果 创伤后2小时腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4的mRNA表达较正常对照组降低(P<0.05),直至创伤后24小时.行不同浓度LPS、PandCSK4刺激后细胞上清液TNF-α水平较对照组降低(P<0.01).结论 严重创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4基因表达降低,受体反应性下降.     

脂多糖结合蛋白对内毒素急性肺损伤大鼠肺巨噬细胞TLR4信号通路的影响

为研究脂多糖结合蛋白（LBP）对内毒素（LPS）急性肺损伤大鼠TLR4肺巨噬细胞信号通路的影响，探讨LBP对LPS炎症反应增敏作用的部分机制，运用RT-PCR和ELISA方法分别检测LBP对LPS刺激后大鼠肺巨噬细胞IL-1β、IL-18mRNA表达与TNF-α分泌量的作用，同时用RT-PCR与Western blot检测其TLR4mRNA与蛋白的表达水平。结果显示，LBP显著增加LPS刺激后大鼠肺巨噬细胞TNF-α的分泌和IL-1β、IL-18mRNA的表达，同时也增加TLR4的mRNA与蛋白表达水平，而LBP多抗能阻断上述作用。说明LBP可增强由TLR4介导的LPS信号跨膜转导功能，这可能是LBP对LPS起增敏作用的重要分子机制之一。     

氯喹抑制EC DNA、内毒素协同诱导的IL-6释放

为明确氯喹抑制细菌DNA，内毒素协同诱导IL－6释放的作用机制，将小鼠于实验前1h经腹腔注射D－DalN敏化，观察氯喹对CpG,ODN或LPS攻击小鼠7天内死亡率的影响；体外培养ANA－1细胞，观察氯喹对EC DNA和LPS共同诱导IL－6释放能力的影响，体外培养THP－1细胞，观察氯喹对EC DNA和LPS刺激THP－1细胞后TLR9、TLR4表达与NF－κB活化的影响。结果发现，小鼠在CpG ODN或LPS攻击后4h内全部死亡，但预先给予氯喹（30mg/kg)的CpG ODN,LPS攻击小鼠仅分别有4只和5只死亡（P＜0．05），氯喹可明显降低EC DNA、LPS协同诱导的IL－6释放（P＜0．01），EC DNA和LPS均可诱导TLR7、TLR4的表达和NF－κBp65的活化，氯喹可显著抑制ECDNA和LPS诱导的TLR8表达的以及LPS诱导的NF－κB活化，对TLR4的表达抑制作用较弱，对CpG ODN诱导的NF－kB活化抑制作用亦较弱，提示氯喹能够明显降低ECDNA和LPS协同诱导的IL－6释放，该作用与氯喹对CpGODN,LPS攻击小鼠的保护作用密切相关。     

烧伤大鼠肺泡巨噬细胞CD14蛋白表达对细胞因子的影响

目的：探讨严重烧伤对大鼠肺泡巨噬细胞(AM)CD14膜蛋白(mCD14)表达变化及其对AM分泌细胞因子的影响。方法：20％Ⅲ度烧伤大鼠检测早期外周血LPS浓度。AM以烧伤血清及LPS刺激，再分别以抗CD14抗体作用，免疫组化检测mCDl4蛋白表达变化；ELISA检测培养液中川TNFα和IL—6浓度。结果：烧伤血清和LPS刺激后．mCD14蛋白表达从1h起就开始增加，2h达峰值，尔后逐渐减弱，上述改变在12h内持续，细胞因子分泌相应增加；抗CD14抗体阻断CD14作用后，mCD14的蛋白表达显著降低，细胞因子分泌亦相应减少。结论：严重烧伤后随LPS增加，激活内毒素信号传导通路，使AM分泌细胞因子增加，此作用可以被抗CDl4抗体所阻断，提示严重烧伤后可以通过调节CD14的作用而减少细胞因子的合成和分泌。     

对细菌内毒素致病作用的新认识

细菌内毒素（LPS）不仅是革兰阴性（G－）细菌细胞壁外膜的主要结构成分，而且是G－细菌感染的主要致病因子，与人类健康和疾病等密切相关，宿主细胞膜上的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRR)是介导细胞识别LPS，并启动LPS反应的首要环节，现已发现清道夫受体（scavenger receptor,SR),CD14,Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4),TLR2,β2整合素和L-selectin等多种膜蛋白参与清除LPS或激活细胞的作用。目前认为，LPS受体可能是多种蛋白组成的复合物，不同宿主个体对LPS反应差异性与其基因背景有关，LPS受体及其诱性的细胞因子等基因的多态性与LPS反应敏感性，脓毒症的易感性和病人预后均存在不同程度的内在联系。     

创伤患者外周血单核细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化

目的 研究创伤患者外周血单核细胞内内毒素复合受体-Toll样受体4（TLR4）/髓样分化蛋白-2（MD-2）mRNA的表达变化，观察其与临床预后的关系。方法 35例创伤患者[损伤严重度评分（ISS）≥9分]与14例正常对照，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增TLR4，MD-2，以β肌动蛋白（β-actin)的表达作为内参照，比较TLR4，MD-2的表达水平；采用鲎试剂法测血浆脂多糖（LPS）浓度；同时观察患者的预后情况。结果 所观察的创伤患者中，血浆LPS浓度均发生不同程度的升高；TLR4，MD-2基因的表达均降低，但预后良好的可在伤后第5天恢复正常水平，预后差的在伤后第5天的表达仍处于低水平。结论 创伤可引起内毒素血症创伤后人外周血单核细胞内TLR4，MD-2mRNA的表达与患者的免疫机能，预后情况密切相关。     

髓样分化蛋白-2在内毒素激活内皮细胞核因子-кB中的作用

目的　探讨髓样分化蛋白 - 2 (myeloiddifferentiationprotein - 2 ,MD - 2 )在内毒素(LPS)对内皮细胞核因子 -кB(NF -кB)激活中的作用。　方法　以ECV30 4细胞为模型 ,逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)方法检测内皮细胞MD - 2mRNA的表达 ;转染MD - 2功能突变体 ,观察MD - 2在内毒素对内皮细胞NF -кB激活和内皮细胞分泌IL - 8中的作用。　结果　内皮细胞有MD - 2mRNA的表达 ,转染MD - 2的突变体能明显抑制内毒素对内皮细胞NF -кB的激活和内皮细胞IL - 8的分泌。　结论　MD - 2在内毒素对内皮细胞NF -κB激活中发挥着不可缺少的作用 ,且在内毒素对内皮细胞激活 /损伤效应中占有重要的地位。     

脂多糖作用巨噬细胞表面TLR4/CD14/MD-2受体复合物表达的变化

目的探讨脂多糖作用小鼠RAW264.7巨噬细胞24 h内细胞表面TLR4/CD14/MD-2受体复合物表达的变化特点。方法分别用低剂量(100 ng/ml)和高剂量(1 000 ng/ml)脂多糖刺激RAW264.7,应用RT-PCR检测TLR4、CD14、MD-2m RNA水平的变化,ELISA检测细胞上清TNF-α含量的变化。结果低剂量脂多糖下调TLR4 m RNA表达,14 h降至最低,24 h维持在低水平表达;CD14和MD-2 m RNA表达增加。高剂量脂多糖上调TLR4 m RNA表达,1 h上升至高峰,此后维持在高水平表达;CD14和MD-2 m RNA表达也明显增强。高剂量脂多糖作用后TNF-α含量显著高于低剂量脂多糖(P<0.05)。结论高剂量脂多糖逆转低剂量脂多糖下调的TLR4表达,提高TLR4/CD14/MD-2受体复合物的表达水平,放大下游信号转导通路的炎症效应。     

1,25（OH）2D3对人血管平滑肌细胞TLR4基因及炎症因子表达的抑制作用

目的探讨1,25（OH）2D3（1,25-dihydroxyvitamin D3）对人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic vascular smooth muscle cell,HA-VSMC）果蝇样受体（Toll like receptor 4,TLR4）基因及其下游炎症因子IL-6、IL-8和MCP-1表达的调节作用。方法不同浓度1,25（OH）2D3干预HA-VSMC后,采用实时荧光定量PCR法检测细胞TLR4、IL-6、IL-8、MCP-1mR-NA的表达水平。结果 1,25（OH）2D3在浓度为1-20nmol/L之间抑制TLR4、IL-6、IL-8、MCP-1mRNA水平的表达且具有明显的剂量依赖关系。在浓度为1nmol/L时1,25（OH）2D3下调TLR4和MCP-1mRNA表达的作用最明显,浓度为10nmol/L时,1,25（OH）2D3下调IL-6mRNA表达的作用最明显,浓度为20nmol/L时,1,25（OH）2D3下调IL-8mRNA表达的作用最明显。TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1mRNA表达的最大下调幅度分别为对照组的3.08、2.39、3.19、2.23倍（均P〈0.05）。结论 1,25（OH）2D3通过下调TLR-4信号抑制了人主动脉血管平滑肌细胞的炎症反应。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

完整迷走神经刺激对肝细胞炎症反应及细胞因子信号转导抑制因子mRNA表达的影响

目的 观察完整迷走神经刺激(IVNS)对肝细胞炎症反应及细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)mRNA的影响.方法 以内毒素血症为全身炎症反应模型.80只SD大鼠随机分为内毒素组、迷走神经刺激组、假手术组和对照组.每组在注射前、注射后2,4,6 h共4个时相点,检测肝组织TNF-α、IL-10水平变化;RT-PCR法检测肝组织SOCS1、SOCS3 mRNA表达.结果 注射LPS后,肝组织TNF-α、IL-10水平升高,其中注射后4 h TNF-α高于注射后2,6 h(P＜0.01,P＜0.05).在LPS注射后的各时相点,迷走神经刺激组TNF-α浓度显著低于内毒素组(P(0.05).注射后4,6 h迷走神经刺激组IL-10水平显著高于注射后2 h水平(P＜0.01),且高于内毒素组(P＜0.05).注射后4 h,LPS组SOCS1、SOCS3 mRNA表达显著高于对照组及假手术组(P＜0.01);迷走神经刺激组SOCS3 mRNA水平高于内毒素组(P＜0.01).结论 IVNS能抑制肝脏炎症反应,其抗炎机制涉及SOCS信号转导途径.     

蜂毒肽MP-1体外拮抗内毒素作用及其机制

目的 观察蜂毒肽MP-1的体外抗内毒素(LPS)活性并探讨其作用机制. 方法 应用生物传感器检测MP-1对类脂A(lipid A)的亲合力,采用动态比浊法鲎试验检测MP-1对LPS(2μg/L)的中和作用,激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度MP-1(5,10,20,40 μmol/L)干预后异硫氰酸荧光素标记LPS(FITC-LPS,100 μg/L)与小鼠RAW264.7细胞的结合,免疫细胞化学法观察MP-1对LPS(100μg/L)诱导的RAW264.7细胞TLR4表达的影响;实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测不同浓度MP-1作用下LPS(100μg/L)刺激的RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6基因及蛋白的表达;MTT法检测MP-1对RAW264.7细胞活力的影响. 结果 MP-1具有一定的结合lipid A及中和LPS的作用,在10 μmol/L浓度可显著抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞结合(P<0.05),并对LPS刺激的小鼠RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6的基因及蛋白表达有抑制作用(P<0.05或<0.01),该作用具有一定的剂量效应关系.MP-1体外实验浓度对细胞活力无影响(P>0.05). 结论 MP-1可能通过中和LPS作用,阻断LPS与RAW264.7细胞膜受体的结合,从而抑制LPS介导的细胞活化.     

内毒素作用下淋巴细胞中CD4＋CD25＋调节性T细胞变化及连翘对其的影响

目的探讨不同时间点内毒素（LPS）对CD4＋CD25＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋regulatory T cell,Treg）的影响及连翘（forsythia suspensa,FS）干预后CD4＋CD25＋调节性T细胞的变化。方法体外培养Wistar大鼠脾脏淋巴细胞,分为对照组、LPS（10ng/ml）组、LPS（10ng/ml）＋多黏菌素B组（10ng/ml）、LPS（10ng/ml）＋连翘（12．5、25、50mg／ml）组,分别于3、6、12h收集标本．流式细胞术检测CD4＋CD25＋调节性T细胞在淋巴细胞中的百分比,荧光定量RT—PCR法检测Foxp3mRNA表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测TNF—a、IL-10分泌水平。结果脾脏淋巴细胞中CD4＋CD25＋Treg的百分比和Foxp3mRNA的表达在12h较3、6h明显升高（P〈0．01）;TNF—a、IL-10的分泌随时间点的延长均显著升高（P〈0．01）;随连翘剂量增加,TNF-a、IL-10分泌水平,Foxp3mRNA表达和CD4＋CD25＋Treg百分比均明显降低（P〈0．05）。结论内毒素参与并诱导了CD4＋CD25＋Treg在淋巴细胞中的变化,其随内毒素作用时间延长呈上升趋势。连翘能显著降低CD4＋CD25＋Treg在淋巴细胞中的百分比。     

葡萄球菌肠毒素A诱导小鼠体内T细胞无能过程中CD28/CTLA-4的变化

目的在葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导小鼠体内T细胞无能的过程中,观察CD28和CTLA-4的变化规律及相互关系。方法单次(1×SEA组,n=4)或多次(2×SEA组,n=4;3×SEA组,n=4)向小鼠腹腔注射SEA,每次注射间隔3d,分别于末次注射后的第1、3、7、14天,将小鼠处死,制备小鼠脾淋巴细胞。通过流式细胞仪检测细胞膜表达CD28和CTLA-4、细胞内表达CTLA-4和IL-2的阳性率。结果1×SEA组,细胞膜CD28和细胞内IL-2的表达显著上升;而CTLA-4在细胞内和细胞膜表面的表达均降低且无明显变化;2×SEA组CD28和IL-2的表达稍有上升;CTLA-4在细胞内和细胞膜表面的表达均明显增加,胞内CTLA-4的增加尤为显著。3×SEA组,细胞膜CD28、细胞膜和细胞内CTLA-4的表达呈下降趋势,细胞内IL-2在第7天已经检测不到。结论SEA初次诱导小鼠脾淋巴细胞时,能显著促进T细胞的活化;经SEA多次(3次)刺激可诱导T细胞的无反应性。在无能的形成过程中,IL-2产生减少与CD28表达下调可能有着密切联系;CTLA-4的表达上调有利于无能的诱导,但可能不参与无能的维持。     

Effects of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on TLRs in acne lesions and keratinocytes co-cultured with P. acnes

ObjectiveTo investigate the effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy (ALA-PDT) on the expression of Toll like receptors (TLRs) in human keratinocytes and its role in acne treatment.MethodsTLR2 and TLR4 expression in acne lesions before and after ALA-PDT were examined by immunohistochemical assay. Primary keratinocytes were obtained from acne lesions, co-cultured with P. acnes and then treated with ALA-PDT using red or blue LED. Cytokines production were examined by ELISA, TLR2 and TLR4 gene expression by real-time PCR, and TLR2 and TLR4 protein expression by Western-blot assay.ResultsThe overexpression of TLR2 and TLR4 in acne lesion were detected, which became negative or weaker after ALA-PDT. The infection of P. acnes in keratinocytes could significantly increase the levels of early inflammatory cytokines (e.g. IL-1α, TNF-α and IL-8) (P < 0.05). Such responses could be inhibited by ALA-PDT. P. acnes infection could also significantly increase TLR2 and TLR4 expressions in keratinocytes (P < 0.05), which could be down-regulated by ALA-PDT.ConclusionsALA-PDT could inhibit innate immune responses in keratinocytes treated with P. acnes via TLRs pathways.     

乳果糖对严重烫伤大鼠血浆循环内毒素及组织中白细胞介素- 18 mRNA基因表达的影响

 目的探讨乳果糖对烫伤大鼠组织中白细胞介素-18 mRNA表达的影响.方法将大鼠致30%体表面积Ⅲ度烫伤,随机分成烫伤对照组(C组)及乳果糖预防组(L组).采用逆转录PCR技术检测肠、肺、肝、肾等组织中IL-18 mRNA水平.结果烫伤后两组体循环内毒素含量显著升高,用乳果糖予处理后可显著降低循环内毒素含量(P＜0.05或P＜0.01).烫伤后,肠、肺、肝、肾等组织中IL-18 mRNA表达较伤前显著升高(P＜0.01),伤后8 h达峰值,24h内居高不下.给予乳果糖予处理后可明显抑制IL-18 mRNA的过度表达(P＜0.05或P＜0.01).结论乳果糖可明显降低体循环内毒素的含量,并明显抑制肠、肺、肝、肾组织中IL-18 mRNA的过度表达.     

烧伤大鼠离体肺泡巨噬细胞CD14的表达及分泌IL-6的调控研究

目的探讨严重烧伤对大鼠肺泡巨噬细胞(AM)CD14膜蛋白(CD14)和mRNA基因表达变化的影响,以及抗CD14抗体对AM产生白细胞介素-6(IL-6)的调控作用。方法20%Ⅲ°烧伤大鼠检测早期外周血内毒素(LPS)浓度。体外分离培养AM,分成烧伤血清组、血清抗体组、内毒素组、内毒素抗体组。RT-PCR方法观察膜表面CD14 mRNA表达、免疫组织化学方法观察蛋白含量及ELISA方法观察分泌IL-6的变化。烧伤血清刺激体外培养的正常大鼠AM,观察培养上清中IL-6浓度变化及CD14抗体的抑制作用。结果烧伤后外周血LPS各时相点LPS浓度均明显高于对照组,与此相对应,烧伤组大鼠AM各时相点CD14 mRNA表达、蛋白含量均明显增高,AM培养上清中IL-6浓度亦显著增高(P<0.01)。以烧伤血清与AM培养1 h后,烧伤组培养上清中IL-6浓度增加值明显高于对照组(P<0.01),而在CD14抗体存在时,IL-6浓度增加值明显小于烧伤组(P<0.01)。结论严重烧伤后外周血LPS浓度增加,AM膜表面CD14受体亦显著增加,使LPS对免疫系统的激活作用显著增大,AM分泌IL-6明显增加。提示严重烧伤后可以通过调节CD14的作用而减少炎性介质的合成和分泌。     

Toll样受体5对间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨Toll样受体5(TLR5)对间充质干细胞(MSC)生物学特性的影响,以期探究TLR5在MSC与肿瘤关系中的作用.方法 构建过表达TLR5的慢病毒载体并用相关病毒感染MSC,通过荧光表达量、RT-qPCR和Western印迹验证TLR5在MSC中的过表达情况,通过MSC-TLR5增殖、表面抗原和细胞分化来验证TLR5过表达对MSC生物学性状影响,通过检测CBLB502激活TLR5后白细胞介素6(IL-6)和IL-8的表达水平验证TLR5生物学功能.结果 TLR5慢病毒感染MSC后,mRNA水平和蛋白水平检测TLR5表达量均显著升高,MSC-TLR5增殖、免疫表型和分化能力未发生改变,同时,CBLB502激活TLR5后,IL-6和IL-8表达量显著升高(P<0.001).结论 携带TLR5的慢病毒感染MSC后不影响MSC生物学功能,TLR5具有功能活性且可激活下游信号通路发挥免疫调节作用.