下调磷酸甘油酸激酶1增强胶质瘤U251细胞的放射敏感性

目的研究磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对胶质瘤U251细胞放射敏感性的影响。方法建立放射抵抗的U251(RR-U251)细胞;LipofectamineTM2000方法将抑制PGK1表达的shRNA-PGK1质粒或对照shRNANC转染至U251细胞;荧光定量PCR及Western Blot检测PGK1的表达;MTT检测细胞相对存活率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果与正常U251细胞相比,RR-U251细胞中PGK1的表达明显增高;放射处理后,RR-U251细胞的相对存活率升高,迁移能力及侵袭能力增强。转染shRNA-PGK1的细胞接受放射处理后,与对照组相比,细胞的相对存活率降低,迁移能力以及侵袭能力减弱。结论下调U251细胞中PGK1的表达可增加其放射敏感性,提示PGK1可能成为增强放射敏感性的调控靶点。     

原肌球蛋白1与胶质瘤放射敏感性的体外研究

目的 研究原肌球蛋白1(tropomyosin 1,TPM1)与胶质瘤U251细胞放射抵抗性之间的关系,为进一步寻找提高胶质瘤的放射敏感性的可能靶点提供理论依据。方法 转染shRNA-TPM1(pc DNA3. 1-TPM1)抑制(诱导) U251和RR-U251细胞的TPM1表达。各组细胞进行放射治疗后,采用MTT法、划痕实验、侵袭实验、流式细胞术分别检测U251(RR-U251)细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡能力。用Western Blot检测TPM1蛋白表达水平,进而观察各组细胞放射敏感性的变化。结果 与U251细胞相比,RR-U251细胞的TPM1蛋白表达水平明显下降(P 0. 01)。各组细胞进行放射治疗后,与对照组相比,沉默TPM1的RR-U251和U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著提高,细胞凋亡率降低(均P 0. 05)。TPM1基因过表达时逆转了这一现象。结论 TPM1可提高胶质瘤U251细胞的放射敏感性。TPM1与胶质瘤细胞的放射抵抗机制有关,其可能是改善胶质瘤放射敏感性的潜在靶点。     

下调磷酸甘油酸激酶 1 对胶质瘤 U373 细胞的放疗增敏作用及其机制的研究

目的研究下调磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对U373细胞的放疗增敏作用;探讨PGK1参与的放疗增敏的可能机制。方法建立放射抵抗U373(RR-U373)细胞;采用Lipofectamine~(TM) 2000将shRNA-PGK1转染至U373细胞;对照组为0 Gy,处理组为5 Gy放射治疗。应用MTT法、划痕实验、Matrigel侵袭实验分别检测放疗前后各组细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力; Western-Blot法检测各组细胞PGK1、CIN(chronophin)和丝切蛋白1(cofilin 1,CFL1)蛋白表达量。结果在U373细胞和RR-U373细胞中,相对于对照组,下调PGK1的细胞在放疗前后的增殖、迁移及侵袭能力均减弱;下调PGK1表达后,CIN、CFL1蛋白表达水平降低。结论下调U373细胞中PGK1的表达对胶质瘤U373细胞有放疗增敏作用。PGK1可能通过调节CIN、CFL1蛋白表达影响胶质瘤细胞对放射的敏感性。     

人脑胶质瘤细胞放射敏感性的实验研究

目的 观察不同人脑胶质瘤细胞的放射敏感性,测定种植系数(PE)和存活分数(SF)等参数并且根据L-Q模型绘制剂量存活曲线,为脑胶质瘤的综合治疗提供重要的参考资料。方法实验采用体外传代培养的11种人脑胶质瘤细胞株,即T98G、SF295、Skmg-1、Skmg-4、MGR-1、MGR-2、MGR-3、UWR-7、SF767、SHG-44和uw28。应用集落形成技术和L-Q模型确定放射敏感性参数及绘制剂量存活曲线。结果11种人脑胶质瘤细胞株的放射敏感性存在较大差异,PE从1.61％到40.89％;SF_2的范围从0.32到0.59,平均为0.44±0.10;SF_8从0.00到3.71×10~(-2),平均为0.42×10~(-2)±1.1×10~(-2)。结论 人脑胶质瘤细胞具有不同的内在放射敏感性。     

抑制SSRP1对胶质瘤细胞增殖、化疗敏感性的影响

目的 探讨结构特异性识别蛋白1(SSRP1)与胶质瘤预后的相关性,以及抑制SSRP1对胶质瘤细胞增殖及化疗敏感性的影响。方法 应用生信分析方法,检索中国胶质瘤数据库CGGA数据集,分析SSRP1表达与胶质瘤预后相关性。体外培养胶质瘤U251、U87细胞,应用CBL0137抑制SSRP1,应用替莫唑胺（TMZ）检测化疗敏感性。应用CCK8法检测细胞增殖,利用免疫印迹法检测MAPK信号通路（p-38、ERK及JNK）表达。结果 生信分析结果显示,胶质瘤SSRP1呈高表达,随胶质瘤级别增加,SSRP1表达明星上调（P<0.05）;SSRP1高表达胶质瘤总生存期明显缩短（P<0.05）。抑制SSRP1,明显抑制体外培养U251、U87细胞增殖（P<0.05）,增加U251、U87细胞对TMZ化疗敏感性（P<0.05）,对U251、U87细胞p-38、ERK及JNK蛋白表达水平无明显影响,但明显降低U251、U87细胞p-38、ERK及JNK蛋白磷酸化水平（P<0.05）。结论 胶质瘤SSRP1呈高表达,与病人不良预后有关;抑制SSRP1,明显抑制胶质瘤细胞增殖,并...     

LRIG1抑制人脑胶质瘤细胞增殖的研究

目的探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法分别构建携带LRIG1、LRIG1小干扰RNA、Bcl2和胶质细胞源性生长因子（BDMF）的质粒,将它们分别转染到人脑胶质瘤细胞系U251细胞内,应用细胞计数试剂盒8法检测细胞活性的变化,蛋白印迹法检测LRIG1、Bcl2、拓扑异构酶Ⅱ（topoⅡ）、GDNF的表达变化。结果成功构建携带LRIG1、LRIG1小干扰RNA、Bcl2、GDNF的质粒,并成功转入U251细胞株。过表达LRIG1显著抑制U251细胞增殖。蛋白印迹法结果显示LRIG1的表达和Bcl2、topoⅡ和GDNF的表达呈显著负相关。结论LRIG1通过负性调节Bcl2、topoⅡ和GDNF的表达抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞的增殖。     

sLRIG1与胶质瘤耐药细胞株化疗敏感性的关系

目的 探讨可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（sLRIG1）与胶质瘤耐药细胞株化疗敏感性之间的关系。方法 浓度梯度递增法建立多药耐药细胞株U251/VP16;CCK-8法检测sLRIG1对U251细胞的抑制率,确定sLRIG1对U251细胞的最佳作用时间及适宜浓度;CCK-8法检测加入sLRIG1前后三种化疗药（依托泊苷、硫酸长春新碱、替莫唑胺）作用于U251/VP16的抑制率变化。结果 成功建立多药耐药细胞株U251/VP16;sLRIG1对U251细胞的最佳作用时间为30 min,适宜浓度范围为100~200 ng/ml;sLRIG1对U251/VP16的抑制率为（23.76±0.02）%;依托泊苷、硫酸长春新碱、替莫唑胺对U251/VP16的抑制率分别为（9.79±0.08）%、（16.71±0.06）%、（27.14±0.09）%;而在加入sLRIG1后抑制率则分别为（20.34±0.03）%、（31.52±0.07）%、（35.21±0.05）%,加入sLRIG1前后三种化疗药的抑制率差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 sLRIG1不仅自身能抑制胶质瘤细胞生长,对耐药胶质瘤细胞的化疗也有增敏作用。     

胶质瘤放射敏感性与EGFR表达关系的探讨

目的探讨EGFR的表达水平与胶质瘤放射敏感性的关系。方法应用免疫组织化学SABC法检测EGFR在5例正常脑组织,2种胶质瘤细胞系及82例不同放射敏感性胶质瘤中的表达。结果EGFR在正常脑组织未见表达,在两种胶质瘤细胞系表达率为100%。EGFR在髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质细胞瘤、低(Ⅰ~Ⅱ级)及高级别(Ⅲ~Ⅳ级)星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤的表达率呈依次上升趋势。髓母细胞瘤表达率最低,与其他各组均有显著性差异(P<0.05)。结论EGFR表达水平与胶质瘤的不同放射敏感性可能相关。     

白藜芦醇通过下调CD44表达抑制胶质瘤U251细胞增殖和侵袭

目的 探讨白藜芦醇对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响及可能的分子调控机制。方法 体外培养胶质瘤U251细胞,分别用浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L白藜芦醇继续培养48 h,参考Lipofectamine2000TM说明书将pcDNA3.1/CD44(CD44过表达)、pcDNA3.1（过表达对照）等质粒转染胶质瘤U251细胞并培养24 h进行后续实验。利用CCK-8法检测细胞增殖,利用Transwell实验检测细胞侵袭;RT-PCR和免疫印迹法检测细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达。结果 白藜芦醇明显抑制U251细胞的增殖和侵袭能力（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）;所以,用150μmol/L白藜芦醇进行CD44干预实验。白藜芦醇明显抑制U251细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）。CD44过表达明显抑制白藜芦醇对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的抑制作用（P<0....     

不同放射敏感性胶质瘤中ATM蛋白、NF-κB表达及相关性研究

目的探讨ATM蛋白、NF-κB在不同放射敏感性胶质瘤中的表达及相互关系。方法应用免疫组织化学SABC法检测ATM蛋白、NF-κB在儿例髓母细胞瘤,12例室管膜瘤,17例少枝胶质细胞瘤,低级别(Ⅰ～Ⅱ级)及高级别星形细胞瘤(Ⅲ～Ⅳ级)各21例和5例正常脑组织中的表达。结果正常脑组织中均未见阳性表达。ATM蛋白、NF-κB在82例不同组织类型胶质瘤中的阳性表达率分别为32.9%、48.8%,二者阳性和阴性同时表达者分别为25.6%、36.5%;ATM蛋白在多形性胶质母细胞瘤表达率最高,在髓母细胞瘤和低级别星形细胞瘤表达较低,髓母细胞瘤中平均光密度值与其他各组均有显著性差异(P<0.05)。NF-κB表达率在髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质细胞瘤、低及高级别星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤中里依次上升趋势。结论ATM蛋白与NF-κB存在相关关系,它们的表达水平与胶质瘤的不同放射敏感性具有相关性。     

p16基因对脑胶质瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系.方法将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6,筛选阳性克隆.同时以空载体质粒为对照,免疫组化检测p16基因表达,用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率.结果转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达,克隆形成率减少,生长速度明显减慢,对辐射的敏感性增强.结论导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性.     

丝切蛋白-1及磷酸甘油酸激酶1在不同放疗敏感性星形胶质细胞瘤中的表达

目的 分析不同放疗敏感性星形胶质细胞瘤蛋白表达特点,筛选与放射耐受关系密切的蛋白质.方法 通过随访胶质瘤切除术后接受三维适型调强放射治疗的患者,按其存活状况及生活质量分为放疗敏感组(7例)和耐受组(8例),病理诊断均为星形胶质细胞瘤(WHOⅡ级).采用二维液相色谱串联质谱法(2D-LC-MS/MS)对入组肿瘤标本进行蛋白组学分析,筛选差异表达蛋白.并对放疗耐受相关蛋白丝切蛋白-1(cofilin-1)及磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)用免疫印记法(Western blot)检测其表达量.结果 2D-LC-MS/MS共鉴定出两组间差异表达蛋白36个,以cofilin-1与PGK1含量最为丰富,在放疗耐受组肿瘤中呈高表达状态.Western blot 检测结果与蛋白组学分析相吻合.结论 放疗后预后不同的同级别星形胶质细胞瘤间蛋白表达差异明显,以cofilin-1及PGK1为代表,可能成为星形胶质细胞瘤放疗耐受的潜在生物标志物.     

PTEN表达对恶性脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究

目的 研究第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)表达对恶性脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot方法检测恶性脑胶质瘤及瘤旁正常组织和细胞的PTEN mRNA和蛋白表达量。对恶性脑胶质瘤T98G细胞进行梯度剂量X线(0、2、4、6 Gy)照射,RT-qPCR和Western blot检测T98G细胞的PTEN表达量。结果 与癌旁正常组织相比,恶性脑胶质瘤组织的PTEN mRNA和蛋白表达量均显著降低(均P 0. 01)。恶性脑胶质瘤U251细胞和T98G细胞的PTEN mRNA和蛋白表达量明显低于正常脑胶质HEB细胞(P 0. 05～0. 01); T98G细胞的PTEN表达量随着X线放射剂量增加而升高。结论 下调PTEN基因的表达能够激活PI3K-AKT-GSK3β信号通路,从而降低恶性脑胶质瘤细胞的放射敏感性。     

反义miR -221/222抑制Akt通路活性提高胶质瘤细胞放射敏感性的研究

目的 探讨敲低miR -221/222表达抑制Akt通路活性提高胶质瘤细胞放射敏感性的作用.方法 脂质体共转染反义寡聚核苷酸(反义miR -221/222)下调胶质瘤U251,LN -229细胞miR -221与miR -222的表达.用Northern印迹方法测定转染后细胞miR -221、miR -222的表达水平;克隆形成实验验证各组胶质瘤细胞的放射敏感性;Western印迹分析各组胶质瘤细胞的pAkt蛋白表达变化;反义miR -221/222联合X线照射治疗裸鼠皮下移植瘤,观察肿瘤生长水平;Real - timePCR检测治疗后miR - 221、miR - 222的表达;免疫组化分析肿瘤组织中pAkt蛋白表达水平.结果 Northern印迹分析显示反义miR -221/222可以有效地敲低胶质瘤细胞的miR -221和miR -222的表达水平.克隆形成实验证实反义miR - 221/222联合X线照射可增加胶质瘤细胞放射敏感性.Western印迹分析显示反义miR -221/222可下调pAkt蛋白表达.经反义miR -221/222转染联合X线照射治疗后,裸鼠皮下移植瘤生长明显受抑,肿瘤组织中miR -221/miR -222表达水平下降,pAkt蛋白表达水平也明显降低.结论 反义miR - 221/222通过抑制Akt通路活性增加胶质瘤细胞的放射敏感性.     

lncRNA MLK7-AS1通过抑制miR-375的表达促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）MLK7-AS1在人脑胶质瘤组织中表达及其对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭的影响。方法 选择2016~2017年手术切除的脑胶质瘤组织标本45例,2007版WHO分级Ⅰ级8例,Ⅱ级15例,Ⅲ级10例,Ⅳ级12例。另选择其中10例瘤旁正常脑组织作对照。体外培养U251细胞和人正常星形胶质细胞（NHA）。U251细胞根据转染质粒分成四组:转染miR-375 mimic组、转染si-MLK7-AS1组、同时转染miR-375 inhibitor和si-MLK7-AS1组以及只转染miR-375 inhibitor组。RT-qPCR检测MLK7-AS1和miR-375的表达水平;荧光素酶报告基因实验验证MLK7-AS1与miR-375之间的关系;CCK-8法检测U251细胞增殖活性,Transwell实验检测U251细胞侵袭能力。结果 高级别胶质瘤组织MLK7-AS1表达水平明显高于低级别胶质瘤组织（P<0.05）,而后者明显高于瘤旁正常脑组织（P<0.05）;高级别胶质瘤组织miR-375表达水平明显低于低级别胶质瘤组织（P<0.05）,而后者明显低于瘤旁正常脑组织（P<0.05）。U251细胞MLK7-AS1表达水平明显高于NHA（P<0.05）,miR-375表达水平明显低于NHA（P<0.05）。序列分析显示MLK7-AS1和miR-375 存在特异性结合序列,荧光素酶报告基因实验表明U251细胞MLK7-AS1负调控miR-375表达。沉默MLK7-AS1表达通过上调miR-375表达明显抑制U251细胞增殖和侵袭（P<0.05）。结论 lncRN AMLK7-AS1可能通过调节miR-375的表达水平在人脑胶质瘤中发挥着促癌的作用     

siRNA干扰整合素α_vβ_3表达抑制脑胶质瘤细胞U251增殖的实验研究

目的 探索特异性siRNA靶向干扰恶性胶质瘤U251细胞中INTα_vβ_3表达后对细胞生长的作用.方法 将INTα_vβ_3特异性siRNA经脂质体(LipofectamineTM~(2000))转染U251细胞.RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot法检测INTα_vβ_3蛋白表达.MTT检测干扰后细胞增殖变化.结果 INTα_vβ_3特异siRNA对U251细胞增殖有明显抑制作用.siRNA组、脂质体组与对照组各时间点的结果 差异有统计学意义.免疫细胞化学对照组和脂质体组均见INTα_vβ_3呈绿色表达,siRNA组表达降低.Western blot法和RT-PCR结果 证实转染特异siRNA后的细胞在蛋白及mRNA水平均能抑制INTα_vβ_3的表达.结论 特异性siRNA可干扰INTα_vβ_3在脑胶质瘤U251细胞中的表达并抑制细胞增殖.     

上调LRIG1对胶质瘤U251细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨上调LRIG1表达对胶质瘤U251细胞侵袭及迁移的影响.方法 体外培养U251细胞,应用Lipofectami-neTM2000试剂盒将质粒pLRIG1-GFP(pLRIG1-GFP组)及其空载pEGFP-N1质粒(pEGFP-N1组)转染U251细胞,G418挑选具有抗性的细胞并扩增,以供进一步实验.另选择...     

蒿甲醚对人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响

目的研究蒿甲醚对体外培养的人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。方法不同浓度蒿甲醚（25、50、100、200、400、800μmol／L）作用U251胶质瘤细胞,四甲基偶氮唑盐法测定药物抑制率和半抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡情况;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡情况。结果蒿甲醚对U251细胞生长抑制率随药物浓度增加而显著增加（P〈O．05）,同时随药物作用时间延长而显著增加（P〈O．05）。药物作用24、48和72h,其IC50分别为849．28±25．89、518．93±32．83和172．99±6．06μmol／L,三者之间均差异显著（P〈0．05）。经400μmol／L蒿甲醚作用48h,Hochest33258荧光染色可观察到凋亡小体。经400μmol／L蒿甲醚作用24、48、72h,细胞凋亡率分别为（4．55±0．24）％、（12．82±1．88）％和（24．22±2．17）％,三者之间均差异显著（P〈0．05）;细胞周期分析显示,随着蒿甲醚作用时间的延长,G0/G1期细胞比例显著增加（P〈0．05）,S期和G2/M期细胞比例显著减少（P〈O．05）。结论蒿甲醚能抑制U251细胞生长,呈剂量和时间依赖性;其机制可能为将细胞阻滞在G0/G1期并诱导其凋亡。     

氯喹通过抑制自噬促进TRAIL诱导的胶质瘤细胞凋亡

目的探讨氯喹对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的胶质瘤细胞凋亡的影响。方法体外培养人脑胶质瘤细胞U251和Hela细胞,分为对照组、氯喹组、重组人TRAIL蛋白(rhTRAIL)组和联用组(氯喹与rhTRAIL联合应用);MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,共聚焦显微镜检测GFP-LC3的分布判断细胞自噬水平,Western Blot检测cleaved caspase-8的表达水平。结果氯喹和rhTRAIL均显著增加U251细胞和Hela细胞自噬水平,而且联用较单独应用自噬水平更高,Hela细胞自噬水平明显高于U251细胞。U251细胞和Hela细胞增殖抑制率和细胞凋亡率:氯喹组与对照组均无统计学差异(P0.05),rhTRAIL和联用组均明显高于氯喹组(P0.05),联用组明显高于rhTRAIL组(P0.05)。氯喹组和对照组Cleaved caspases-8水平无统计学差异(P0.05),rhTRAIL和联用组均明显增高(P0.05),联用组明显高于rhTRAIL组(P0.05)。结论氯喹能通过抑制细胞自噬,增强TRAIL诱导的U251细胞凋亡。