鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.     

人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择

本实验利用实时荧光定量PCR对极大节选藻中16SrRNA、TEF(翻译延伸因子,GTPases)、RPL13(核糖体蛋白)、PSR(藻蓝蛋白β亚基)、CYP(亲环素家族)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、Hsp(热休克蛋白)和rpoD(RNA聚合酶σ70因子)八个候选基因在正常生长和持续光照条件下的稳定性进行了检测。用geNorm软件对实验数据进行处理,从中选出合适的内参基因。结果表明RPL13和CYP38可以作为正常生长和持续光照处理下极大节选藻节律性研究通用的内参基因16SrRNA基因的稳定性要低于其他的候选内参基因,并不是一个合适的内参基因。     

小苍兰实时荧光定量PCR中的内参基因筛选

筛选适用于小苍兰实时荧光定量PCR的内参基因,为准确研究小苍兰基因表达,尤其是种球发育相关基因的表达分析提供参考。     

实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展

实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,已成为分子生物学和其它领域的重要技术工具。本文对实时荧光定量PCR技术的原理及其在食品、医学、环保领域的应用进行综述。     

应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法

介绍一种采用实时荧光定量PCR法鉴定重组细胞株基因组中外源基因拷贝数的方法.首先根据研究对象建立标准品,以拟检测的外源基因设计特定的引物,得出标准曲线,然后在不同重组细胞株中对外源基因进行Real-Time PCR鉴定,根据结果与标准品比对得出实际的拷贝数.结果表明:以转染sPDGFRα基因的重组CHO-K1细胞为例,采用该方法,利用标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系,并且具有较大的线性范围(101-105拷贝);测得各重组细胞株外源基因拷贝数不同,3次独立实验表明结果一致.与传统杂交技术鉴定转基因拷贝数相比,该方法具有高效省时、更稳定、高通量和低成本等优点.     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出蚕豆盐胁迫下不同组织中表达稳定的内参基因,本研究以不同浓度氯化钠胁迫下的蚕豆叶片、茎、根为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测ELF1 A、ACT2、GAPA、18S rRNA、TUA和CYP2六个候选内参基因的表达情况;通过Ct值分析、及GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析候选...     

一种简便、高效的实时荧光PCR 相对定量方法的建立

摘要: 目的建立一种简便、高效的实时荧光PCR 相对定量方法。方法采用严格一致的引物参数,对Fabp5、 Ppar-α 及β-Actin 三个基因分别设计特异性扩增引物,制备相应的质粒标准品,10 倍梯度稀释后制作标准曲线。并以这三个标准曲线分别单独定量正常小鼠肝组织、H-ras12V 转基因小鼠肝肿瘤周围组织和肿瘤组织中的Fabp5、Ppar-α 和β-Actin 的表达水平,以β-Actin 为内参,分别采用双标准曲线法、2 － △△Ct 法和单标准曲线法对Fabp5 和Ppar-α 的表达进行相对定量分析。结果单标准曲线法与双标准曲线法测定的Fabp5 和Ppar-α 差异性表达的相对定量值没有显著差异,而用2 － △△Ct法获得的相对定量值与双标准曲线法相比,波动较大。结论在引物参数严 格一致的基础上,单标准曲线法是一种可行、简便、高效的实时荧光PCR 相对定量方法。     

RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因 转录水平方法的建立

目的 建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法 提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA, 以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

实时定量PCR鉴定转基因作物纯合体

以水稻内标准基因磷脂酶D基因(phospholipase D,PLD)和转基因水稻TT51-1特异性旁侧序列为检测靶标,对单株转基因水稻的种子播种后长出的单株进行了荧光定量PCR,以其内标准基因和旁侧序列Ct值的差值判断了植株的纯合体,并用标准曲线计算了转基因含量,证实了此法的可靠性,说明此法用于鉴定植株的纯合体简便准确.     

中国两性生殖卤虫早期胚胎发育蛋白的双向电泳条件优化

采用双向电泳技术对中国卤虫胚胎发育到5 h时的蛋白组进行研究与分析.考察不同条件对双向电泳结果的影响,分别从上样量、染色方法、分离胶浓度等3方面进行研究.实验结果显示上样量为400 μg时图谱的斑点数较多;采用银染法所得实验结果优于考染;同时分离胶浓度为10%时所得蛋白斑点数较多.优化的实验条件为进一步研究中国卤虫蛋白组奠定基础.     

"突触引物"实时荧光PCR检测端粒酶活性

为建立一种简便的端粒酶测定方法，首先采用高灵敏的核酸染料SYBR Gold染色代替放射自显影，建立了简便可靠的扩增产物显示方法，进而合成了端粒酶扩增产物的模拟产物，考察了突触引物检测的可行性和灵敏度。在此基础上，建立了检测端粒酶活性实时荧光PCR。由于突触引物可以有效的降低非特异性扩增，有效解决了端粒酶活性检测中的非特异产物干扰，为定量检测端粒酶活性打下了基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

重组腺相关病毒质量控制的qPCR技术研究进展

综述实时荧光定量PCR(qPCR)技术在重组腺相关病毒(rAAV)的基因组滴度测定中的应用成果,以及qPCR技术在rAAV质量控制过程中的应用,如感染滴度及rcAAV污染率的测定等.分析qPCR技术存在的适用范围窄、易产生系统性误差和易受rAAV杂质干扰等问题的原因,并探讨相关的解决策略.     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

为了快速、准确定量多鳍鱼Shh基因在机体组织中的表达水平,根据笔者克隆的Shh基因序列,选择其高度保守区域设计一对引物,对多鳍鱼各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α。筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明Shh基因保守区段已经成功克隆。将重组标准品质粒进行倍比稀释,然后以此为模板,进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归方程为y=-0.32x 10.47,回归系数为1.00。构建Shh基因表达检测标准品质粒和标准曲线,建立检测多鳍鱼Shh基因荧光定量PCR方法,为进一步研究Shh基因在组织中的动态分布和研究多鳍鱼系统发育奠定了基础。