病毒介导造血干细胞基因转移

造血干细胞是体细胞基因治疗尝试的主要靶细胞之一，造血干细胞基因转移具极大的疾病治疗潜能，可应用于治疗造血细胞及非造血系统的遗传性和获得性疾病。     

重组腺病毒介导GDNF基因在多种细胞的高效转移和表达

用作者等所构建的重组腺病毒AdCMVgdnf直接感染多种细胞系和大鼠中脑原代神经元细胞，多重感染复数为20PFU／ml。采用免疫组织化学染色方法检测GDNF表达，观察所构建的GDNF重组腺病毒在各种细胞中介导GDNF基因转移和基因表达的能力。结果表明在一系列神经细胞或非神经细胞中，GDNF重组腺病毒均可介导GDNF基因的高效转移和表达。提示GDNF重组腺病毒可作为帕金森氏病基因治疗的高效基因转移载体。     

病毒性载体介导的基因转移研究进展

病毒性载体介导的基因转移研究进展迅残,并率先用于临床基因治疗试验。目前研究重点在对其进一步完善和发展,以及发现新的适于基因治疗的病毒性裁体,已获部分突破性进展,大大加速了基因治疗研究的进程,但也存在一些限制因素,尚需深入研究。     

阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景：与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染。 目的：介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展。 方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI：1987/2010)和PubMed (1987/2010)数据库,检索词分别为“基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制”和“gene therapy, cationic liposome, gene transfer, mechanism”,语言分别设定为中文和英文。从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制。 结果与结论：共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章。综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容。结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键。     

ADA活性紫外吸收测定法的改良及复感儿淋巴细胞该酶活性的…

检测了４２例健康儿童和１７例反复上呼吸道感染患儿（复感儿）的血淋巴细胞腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）活性，结果表明，复感儿的血淋巴细胞中ＡＤＡ活性较健康儿童低下，且大多同样伴有不同程度的免疫功能低下，从复感儿组中筛选了两例ＡＤＡ活性和免疫功能量显低下的患儿，拟采用这两例患儿的血淋巴细胞进行ＡＤＡ－ＳＣＩＤ基因治疗的实验研究。     

ADA活性紫外吸收测定法的改良及复感儿淋巴细胞该酶活性的检测

检测了42例健康儿童和17例反复上呼吸道感染患儿（复感儿）的血淋巴细胞腺苷脱氨酶（ADA）活性，结果表明：复感儿的血淋巴细胞中ADA活性较健康儿童低下，且大多同样伴有不同程度的免疫功能低下；从复感儿组中筛选了两侧ADA活性和免疫功能明显低下的患儿，拟采用这两例患儿的血淋巴细胞进行ADA－SCID基因治疗的实验研究。     

逆转录病毒载体介导的IL—4基因修饰对HL—60细胞？…

目的 观察ＩＬ－４基因转染对ＨＬ－６０增殖及Ｔ细胞功能的影响及其可能机制。方法 采用逆转病毒载体介民基因转染法将人ＩＬ－４基因导入髓系白血病细胞ＨＬ－６０,观察高表达外源性ＩＬ－４基因ＨＬ－６０株的增殖反应及其诱导的正常人ＰＢＭＣ增殖,ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ基因表达及肿瘤特异性ＣＴＬ杀伤活性。结果 ｒＩＬ－４或瘤细胞产生的ＩＬ－４早期促进ＨＬ－６０细胞增殖,培养５天后则明显和抑制其增殖;与     

电击介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在肌肉中的转移和表达

目的探讨电击提高人凝血因子Ⅸ(human clotting factor     

碱性成纤维生长因子受体介导的基因转移系统的建立

化学合成Ｎ端含多个赖氨酸残基、Ｃ端为人碱性成纤维生长因子的受体结合的２６肽（ＦＤＫ９）;经细胞培养,基因转染,报道基因检测等实验。结果表明,合成肽ＦＤＫ９能通过电性中和与ＤＮＡ分子结合,ＤＮＡ凝胶阻滞试验表明浓度为Ａ＝１的ＦＤＫ９肽每４μ轻能与１μＬ萤光虫我素酶表达质粒ｐＥＢｌｕｃ完全结合,核酸复合物直接加入人脐静脉内皮细胞的培养液中,４８ｈ后可从细胞裂解液中测出荧光素酶的显著表达,而缺乏ｂＦＧＦ     

ADA同工酶醋纤薄膜电泳法的建立及其在基因转移实验中的应用

本文建立了一种ADA同工酶醋纤电沐法．本电泳方法选用醋酸纤维薄膜为电泳主持物，可将人、鼠的红细胞及淋巴细胞中的ADA同工酶有效分离开来；以进行了人ADA基因转移后的鼠T淋巴细胞株Yac-I作为检测样品，用本电泳法进行了检测，结果显示：经基因转移并筛选后的细胞较基因转移前的细胞额外出现了一条泳动速率与人ADA同工酶相同的电泳带。这表明本法对ADA基因转移后的表达产物的分析检测具有应用价值。     

ADA—LacZ融合基因直接注射导入大鼠骨骼肌后的表达

ＡＤＡ－ＬａｃＺ融合基因经直接注射导入大鼠骨骼肌内，用Ｘ－ｇａｌ和ＡＤＡ组化染色方法检测的结果表明：在大鼠骨骼肌细胞中，可检测到由ｐＦＰ表达的ＡＤＡ和β－ｇａｌ活性。这提示有望探索出一条对某些遗传性疾病、肿瘤及其它多种疾病导入外源基因实施基因治疗的便捷、可行的途径     

外源性IL-4基因表达对K562细胞增殖及死亡的影响

目的：观察外源性ＩＬ－４对Ｋ５６２增殖及死亡的影响。方法：用逆转录病毒载体将ＩＬ－４ｃＤＮＡ导入Ｋ５６２细胞,检测其增殖反应,用流式细胞依及ＤＮＡ片段凝胶电泳检测细胞增殖周期及凋亡情况,用台盼蓝排除法计数死亡细胞。结果：高表达ＩＬ－４的Ｋ５６２细胞增殖反应明显低于表达株。亲代Ｋ５６２株;前者２过程中死亡细胞百分率明显升高且可被ＩＬ－４单克隆抗体阻断,但其自发凋亡细胞数及增殖周期均无改变。结论Ｌ：外     

Tet基因表达调控系统及其应用

 基因治疗中导入基因表达时间和水平的调控极其重要。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关，如热休克蛋白（Hsp）启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子等，但这些系统均存在着诱导表达不具备特异性、系统处于关闭状态时表达有遗漏以及诱导剂本身具有毒性会对细胞造成损伤等缺陷。如果设置一种导入基因的“开关”，能调控基因的表达，则有望大幅度提高基因治疗在临床应用的安全性。1992 年，Gossen 和 Bujard^[1]首次成功地利用原核基因调控元件构建了真核细胞基因表达调控系统——四环素基因表达调控系统（Tet 系统），该系统能通过在培养基中加入或者去除四环素或其衍生物（如强力霉素）诱导或抑制所感兴趣基因的表达，故被广泛应用于基因表达调控、蛋白质功能和基因功能研究以及基因治疗研究中。本文就近年来 Tet 系统的研究进展等做一综述。 1 Tet 系统概述 1.1 Tet 系统作用原理 大肠杆菌转座子 Tn10 中 Tet 阻遏因子（TetR）负性调节四环素抗性操纵子，TetR 与四环素有很高的亲和性，在无四环素时，TetR 与 Tet 操纵因子序列（TetO）结合而阻断四环素抗性基因的表达；当四环素存在时，TetR 对 TetO 的阻遏解除，转录启动，从而调控基因的表达。....     

Epstein-Barr病毒载体介导的白细胞介素12在肝癌细胞中的靶向表达

目的研究白细胞介素－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２，ＩＬ－１２）在肝癌细胞靶向性表达，探索肝癌基因治疗新方法。方法将白介素－１２分别克隆到带有人甲胎蛋白启动子和增强子的Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（ＥＢ）病毒载体中，得到重组表达载体ｐＥＢＡＦ／Ｐ３５和ｐＥＢＡＦ／Ｐ４０，分别在４种细胞系中作共转染，用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各细胞系中ＩＬ－１２的表达情况。结果用ｐＥＢＡＦ／Ｐ３５和ｐＥＢＡＦ／Ｐ４０共转染４种细胞后ＩＬ－１２基因只在产生甲胎蛋白的肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）中表达，活性检测证明，表达的ＩＬ－１２有诱使ＩＦＮ－γ产生的生物学活性。结论本研究在肝癌细胞中靶向性和组织特异性的表达了有活性的ＩＬ－１２，为既能杀死肝癌细胞，又不影响正常肝细胞功能的新型基因治疗方案做了有益的探索。     

自身免疫性疾病的基因治疗研究进展

自身免疫性疾病是危害人类健康的重要疾病。随着基因转移技术的发展,基因治疗在自身免疫性疾病中的研究取得了一定进展。通过选择合适的载体转导免疫调节分子、缺陷基因、激活因子、细胞凋亡受体以及诱导免疫耐受等方式来达到治疗目的。与传统的治疗方法相比,基因治疗具有高效性、靶向性、副作用小等优点。近几年来自身免疫性疾病的基因治疗在临床前实验和临床实验阶段取得了很多成果。     

人类肿瘤表达细胞因子基因的临床意义

目的:探讨IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-13和IFNγ在肿瘤发生发展及治疗诊断中作用。方法:用RTPCR技术或RNA点杂交技术检测183份肿瘤细胞或肿瘤组织中上述6种细胞因子的基因表达状况。结果:在183份不同的肿瘤细胞或组织中Th2类细胞因子的表达显著增加,其中IL-4,IL-6,IL-10和IL-13的表达率达65％,70.5％,83.6％和61.7％,而Th1类细胞因子IFNγ和IL-2的表达率仅达12.6％和22.9％。结论:Th1/Th2漂移与肿瘤的发生发展密切相关,有可能造成机体的免疫抑制,有利于肿瘤细胞的免疫逃逸。     

使用热休克蛋白基因启动子调控靶基因在肿瘤局部表达

目的：利用人热休克蛋白基因启动子结合加热选择性诱导目的基因在肿瘤局部表达,建立肿瘤基因治疗新方法。方法：分离不同大小的人热休克蛋白70基因5’端调控顺序作为启动子,以绿色荧光蛋白（GFP）作报告基因,构建热诱导型GFP表达质粒,转染体外培养的肿瘤细胞,或将稳定转导GFP表达质粒的肿瘤细胞移植到大鼠皮窗内,或将热诱导型GFP腺病毒注射到肿瘤内,加热后直接利用荧光显微镜观察GFP表达水平。结果：400bp人热休克蛋白70基因5’端调控顺序背景表达水平低,加热后可被显著激活,能作为启子有效驱动下游目的基因的表达,GFP作报告基因使体内外肿瘤细胞内目的基因的表达水平仅通过荧光显微镜便能直接观察到。结论：利用热诱导型启子结合加热能选择性诱导目的基因在肿瘤局部表达,为肿瘤基因治疗提供了一种新方法。     

TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化

目的克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段.方法抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定.将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Westem-blot鉴定纯化产物.结果抗CD3 McAb能诱导正常人外周血单个核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达带.Kodak软件分析表面GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8 mg纯度的95%以上的GST-Tex.Western-blot结果证实54KD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应.结论成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.