不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

改良红鲫Dmc1基因编码阅读框的克隆及表达

Dmc1基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的基因,其表达产物为减数分裂时同源染色体配对所必需。本实验根据普通红鲫Dmc1基因编码阅读框(ORF)序列设计引物,克隆了改良红鲫Dmc1基因(命名为IRCC-Dmc1)的ORF序列并将之插入到cDNA5-FRT/TO载体中,构建了改良红鲫Dmc1基因表达载体FRT/TO-IRCC-Dmc1-Myc。以FRT/TO-IRCC-Dmc1-Myc质粒转染HEK293T细胞,蛋白印迹杂交实验检测到改良红鲫Dmc1基因在HEK293T细胞中有着正确的表达。本文为将来进一步研究改良红鲫Dmc1基因的功能打下了基础。     

雌核发育二倍体鲫鲤杂交克隆品系建立

研究了雌核发育二倍体鲫鲤第2代(G₂)产生的二倍体卵子在无染色体加倍情况下形成第3代(G3)的雌核发育细胞学行为,G₃,G₂×散鳞镜鲤和G₂×四倍体鲫鲤的染色体数目.研究结果表明:(ⅰ)G₂产生的二倍体卵子无需染色体加倍处理,仅在灭活散鳞镜鲤精子激活下,形成了大量G₃.(ⅱ)G₃和雌核发育二倍体鲫鲤第1代(G₁)、G₂一样,也表现出杂交特征,并且都是二倍体(2n=100);G₂与二倍体散鳞镜鲤和四倍体鲫鲤分别交配形成了三倍体(3n=150)和四倍体(4n=200)鱼;(ⅲ)二倍体G₂产生的二倍体卵子在雌核发育过程中,有明显第二极体排出,排除了二倍体卵子源于第二极体保留的可能.另外,还对二倍体鲫鲤产生二倍体卵子的机制进行了讨论.雌核发育二倍体鲫鲤杂交克隆品系建立证明二倍体卵子通过雌核发育形式可形成一个能产生二倍体卵子的新型二倍体鲫鲤品系,二倍体鲫鲤产生二倍体卵子的特殊繁殖方式在生物进化和生产应用方面都具有重要意义.     

日本白鲫IGF-1基因全长cDNA克隆及组织表达分析

通过已获得的多个物种IGF-1基因的cDNA序列,设计合成简并引物,用日本白鲫的肝脏总RNA反转录获得的cDNA做模板,克隆获得了IGF-1中间序列.在此基础上,通过SMART RACE,获得了IGF-1全长cDNA序列.经过序列对比分析,所得到的序列是日本白鲫(Carassius cuvieri)IGF-1 cDNA全长,其中开放阅读框为486 bp,编码含161个氨基酸的蛋白质,该蛋白质含有保守的信号肽、B、C、A、D和E结构域和6个半胱氨酸残基.同时,系统进化分析表明,在进化过程中IGF-1基因在鱼类中保持着高度保守的进化特征.IGF-1在日本白鲫中广泛表达于多个组织,尤其在肝脏中表达量最高.在垂体、心脏、肾脏和肌肉中有较高的表达.而在脑、脾脏、精巢和卵巢中的表达量较低.     

建兰Actin基因cDNA全长的克隆及其表达分析

根据单子叶植物的肌动蛋白基因(Actin)的保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术从建兰(Cymbidium ensifolium)中分离出Actin基因cDNA全长.序列分析结果表明,建兰Actin基因长度为1 434 bp,编码区长度为1 134 bp,编码377个氨基酸,将其命名为CeActin,GenBank登录号为JN613147.CeActin推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都较高,具有高度的保守性.采用半定量RT-PCR技术分析CeActin在建兰各组织及花不同发育时期的表达情况,结果表明,表达量没有明显差异,表明CeActin基因可作为内参基因.     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。     

彩鲫Ran基因全长cDNA的克隆及其组织表达特异性分析

根据Ran的保守区序列设计简并引物,结合SMART、cDNA合成及RACE-PCR技术,克隆到彩鲫(Carassius auratus color variety)的Ran基因的cDNA全长,其编码区全长为648bp,编码215个氨基酸。采用BIAST程序在NCBI数据库中对其进行同源基因搜索,结果表明,其推测的编码氨基酸序列与斑马鱼和鲑鱼的Ran基因编码的氨基酸序列的同源性分别高达98％和97％。还对其编码区全长序列进行了原核表达,以经纯化的表达蛋白免疫家兔,制备出了具有较高特异性的多克隆抗体。采用Western blotting进行的组织特异性分析表明,Ran蛋白在卵巢、精巢和肾中表达,在心、脑、肝、脾和肌肉中不表达。本工作为采用免疫耗竭法、免疫共沉淀、体外系统模拟等方法进一步研究鱼类．Ran基因的生理功能及分离鉴定其结合蛋白提供了良好基础。     

棉铃虫HaKettin1基因的全长cDNA克隆、序列分析和表达谱

【目的】为了克隆棉铃虫Helicoverpa armigera编码肌肉蛋白Kettin基因的全长cDNA序列以及鉴定该基因在棉铃虫发育周期内的表达模式。【方法】利用兼并引物,通过分段RT-PCR和5′-和3′-RACE的方法克隆全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR进行表达谱分析。【结果】编码棉铃虫Kettin蛋白的基因HaKettin1全长cDNA序列为13 805 bp,包含一个13 365 bp的开放阅读框,编码4 454个氨基酸,蛋白分子量约为504.3 kD。组织表达结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个生育周期都有表达,幼虫期的表达尤为显著。【结论】HaKettin1与家蚕的Kettin蛋白具有90％的同源性,表明鳞翅目昆虫的Kettin蛋白之间具有很高的保守性。表达谱结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个发育过程中都发挥重要作用。     

苎麻纤维素合酶基因BnCesA1全长cDNA的克隆与表达分析

苎麻是中国的传统纤维作物,能够生产最长的自然纤维。本研究旨在克隆苎麻纤维素合酶基因BnCesA1全长编码序列,对其表达模式进行分析。以已知的苎麻纤维素合酶基因序列(DQ077190)为基础,设计5’RACE引物,以湘苎三号为材料,得到了BnCesA1的5’端,拼接后得到了BnCesA1的全长序列,并从湘苎三号的cDNA中成功克隆到包括BnCesA1全部编码序列的cDNA序列。扩增得到的BnCesA1基因cDNA为3253bp,编码区3246bp,编码含1082个氨基酸的多肽。通过对这个基因进行核酸序列和蛋白结构域分析表明,BnCesA1和毛果杨、欧美山杨、巨桉、大叶相思等其他物种的纤维素合酶基因都有很高的同源性,根据得到的BnCesA1的5’端设计特异性表达检测引物,分析其在湘苎三号苎麻品种各组织中的表达情况,结果显示BnCesA1在所检测的各组织中均有表达,表达量为茎皮>叶>顶芽>根。本研究首次克隆到苎麻中编码全长蛋白的纤维素合酶基因,并且苎麻BnCesA1在茎皮中高表达提示该基因可能在苎麻韧皮纤维合成中有重要作用。     

家鸽Caveolin-1基因全长cDNA的克隆、序列和组织表达分析

窖蛋白(Caveolin)是一类构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白,由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-1基因是Caveolin基因家族的成员之一。该实验采用RT-PCR与RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术成功地克隆了家鸽Caveolin-1基因的全长cDNA。该cDNA全长2605bp,包含537bp的完整编码区,编码178个氨基酸;分析发现家鸽Caveolin-1基因编码区与牛、家犬、鸡、褐家鼠等核苷酸同源性为80.1%～93.4%,氨基酸同源性高达85.4%～97.2%;半定量RT-PCR分析表明该基因在家鸽各种组织广泛表达,脂肪中表达量最高,各种肌肉中表达量次之,肝脏中表达量最低。此结果说明家鸽Caveolin-1基因可能与脂肪、肌肉中的某些代谢途径有关。     

文昌鱼AmphiDC-like的全长cDNA克隆及其表达模式分析

本文旨在克隆文昌鱼树突样蛋白基因AmphiDC-like,采用实时 PCR法和原位分子杂交法对其表达模式进行分析.从文昌鱼神经胚cDNA文库测序得到的ESTs中筛选得到该基因片段,通过引物步移直接测序的方法,克隆得到其cDNA全长序列,对其推测的氨基酸序列进行同源性分析发现,该基因产物具有树突样细胞蛋白共有的保守区,并与多种生物的树突状细胞蛋白具有高度同源性,其中与脊椎动物的树突样细胞蛋白同源性较高. 实时 PCR结果显示, AmphiDC-like在文昌鱼受副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,Vp)感染后6 h到48 h表达均上调,并通过原位分子杂交技术观察到,该基因在文昌鱼鳃和消化道中有表达,为深入研究其功能奠定了基础.     

茶树肌动蛋白基因（CsActin1）全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树（Camellia sinensis）萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白（actin）基因的5′-片段设计引物,利用3′-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1（GenBank登录号HQ235647）。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区100 bp,3′非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列（YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE）和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列（LLTEApLNPkaNR）。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。     

甜瓜HMGR基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据已报道的reticulatus甜瓜的HMGR cDNA序列设计合成引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜幼果总RNA中克隆得到HMGR的全长cDNA序列,共1 939 bp,编码588个氨基酸。序列比对及系统发育分析表明,该HMGR cD-NA序列与已报道的reticulatus甜瓜HMGR基因cDNA序列完全一致,和拟南芥HMG1亲缘关系最近。该基因的克隆为研究该基因在甜瓜中的表达特性及其功能奠定基础。     

鲂鲌杂交鱼染色体减数分裂特征及相关基因分析

突破种间生殖难关,建立可育品系,在远缘杂交的遗传理论的创新和遗传育种方面都具有重要意义.本课题组利用团头鲂(Megalobrama amblycephala,BSB,2n=48,♀)与翘嘴鲌(Culter alburnus,TC,2n=48,♂)进行属间杂交,突破了鱼类远缘杂交生殖障碍,建立了鲂鲌杂交品系(BTF1-B...     

木薯磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因全长cDNA克隆及表达分析

应用巢式PCR从木薯栽培种(Manihot esculenta)Arg7和野生种W14(M.esculenta subsp.flabellifolia)叶片中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pepc全长cDNA,GenBank序列号为JN387052和JN387053。cDNA全长2945 bp,含1个2895 bp的开放阅读框,预测编码的蛋白含964个氨基酸,具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶保守结构域。木薯PEPC与麻疯树和蓖麻的PEPC氨基酸序列具有高度同源性。表达分析表明pepc在W14和Arg7叶中的表达量最高,其次是须根和块根,茎中最低。单日表达量动态分析表明,Arg7叶中pepc总体表达量高于W14,但是16∶00后W14高于Arg7,推测两种木薯pepc调控区域存在差异。     

黄芩查尔酮异构酶基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析

目的：从黄芩叶片克隆全长查尔酮异构酶基因chi并进行功能鉴定。方法：从黄芩叶片mRNA中RT-PCR获得全长chi基因并进行生物信息学分析。结果：克隆的chi基因全长648 bp,含有完整chi基因的开放阅读框,拟编码215个氨基酸,具有查尔酮异构酶催化特有的结构域PLN02559,属于查尔酮＿3超家族。构建表达载体pET-32a(+)-chi,在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达出一个30.0 kDa的融合蛋白。结论：分析表明,黄芩叶片chi与从黄芩组培毛状根、愈伤组织的chi基因序列几乎完全相同,预示黄芩叶片可替代野生黄芩根用药,为野生黄芩资源的可持续利用提供理论依据。     

白桦肌动蛋白(Actin)基因全长cDNA克隆与序列分析

以白桦(Betula platyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1 785 bp,序列分析表明,该基因编码区1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157 bp,3′非编码区495 bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册（EU588981）。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。     

绵羊cdh1基因cDNA全编码区的克隆及序列分析

在哺乳动物成体睾丸中,精子发生的过程开始于未分化的A型精原细胞的干细胞群.目前已有报道在小鼠未分化的A型精原细胞中特异性表达钙依赖性跨膜黏着蛋白基因(cdh1),但绵羊的cdh1基因全序列未见报道.为了更好地研究绵羊精原干细胞的特性,根据已报道的其他物种的cdh1基因的cDNA保守区设计引物,从成年蒙古绵羊睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆方法克隆了蒙古绵羊cdh1基因cDNA全编码区.DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为96.5％,说明该基因在进化上是高度保守的.这为制备绵羊CDHI的抗体奠定了基础,并且为绵羊精原干细胞的分子水平鉴定提供了研究备件.