DNA氧化损伤修复相关基因hOGG1、MGMT在肺癌细胞中表达研究

目的研究DNA氧化损伤修复相关基因hOGG1和MGMT在正常人支气管上皮细胞(Human bronchial epithe-lial,16HBE)、反式7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(BPDE)转化细胞和裸鼠成瘤细胞中的表达。方法采用原位杂交技术检测hOGG1和MGMT在正常16HBE、反式BPDE转化细胞和裸鼠成瘤细胞中mRNA水平的表达。结果hOGG1、MGMT mRNA在反式BPDE转化细胞中阳性表达明显增强,而在裸鼠成瘤细胞中阳性表达相应减弱。结论DNA损伤修复相关基因hOGG1、MGMT mRNA在转化细胞模型中的表达水平明显增强。     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

叶绿酸对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘抗细胞转化活性的影响

目的研究叶绿酸对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发的SV40 large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的抑制作用.方法在反式- BPDE诱导的细胞转化整个过程中,分别加入浓度为10、50和100 μmol/L的叶绿酸,应用刀豆凝集素(ConA)凝集实验、软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验进行细胞恶性度鉴定.结果细胞培养至25代,发现叶绿酸和反式-BPDE共处理组细胞与反式-BPDE单独处理组细胞相比,前者ConA凝集时间延长;叶绿酸和反式-BPDE共处理组细胞在软琼脂中集落形成率分别为7.4‰、11.4‰和14.4‰,明显低于反式-BPDE单独处理组(19.6‰),且有剂量反应关系;各处理组细胞均能在裸鼠体内成瘤,叶绿酸和BPDE共处理组在裸鼠体内生长的肿瘤体积分别为(0.43±0.13) cm3、(0.22±0.04) cm3、(0.10±0.06) cm3,明显小于BPDE单独处理组的(1.71±0.37)cm3,并有剂量依赖关系,肿瘤组织经病理学证实为低分化鳞状细胞癌.结论体外试验显示叶绿酸具有一定的抗细胞恶变能力.     

反式BPDE诱发的转化细胞与成瘤细胞FHIT基因变化研究

目的:探讨苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE]引起的细胞FHIT基因突变情况。方法:PCR、RT-PCR、多聚酶链聚合反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)。结果:PCR-SSCP结果提示反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞FHIT基因的Exon1-9出现了异常的小片断。结论:反式BPDE可作用于细胞染色体3p14.2的脆性部位FRA3B,引起FHIT基因的重排或缺失,导致FHIT基因功能失活。推测FHIT基因可能是反式BPDE致癌作用的靶分子之一。     

叶绿酸对恶性转化细胞周期及体外生长的影响

目的研究叶绿酸对反式7，8二羟9，10环氧苯并(a)芘(反式BPDE)恶性转化人支气管上皮细胞系(16HBE)体外生长及细胞周期影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(FCM)，同时观察正常人支气管上皮细胞(16HBE)、反式-BPDE恶性转化细胞系、叶绿酸抗反式-BPDE恶性转化细胞系生长曲线和生长周期的变化以及经叶绿酸处理后的影响。结果BPDE恶性转化细胞系增殖活性明显大于正常细胞系(16HBE)，经100μmol／L叶绿酸抗BPDE恶性转化细胞组增殖活性较转化组有一定降低。经同样浓度叶绿酸处理的正常细胞组，未见降低细胞增殖活性作用。反式-BPDE恶性转化细胞组G0／G1期细胞周期比例明显少于正常组细胞。但经叶绿酸抗转化组G0／G1期比例有所提高，而经同样浓度叶绿酸处理的正常细胞组G0／G1期细胞周期比例无明显改变。结论对正常细胞无影响的一定浓度叶绿酸有抑制反式-BPDE恶性转化人支气管上皮细胞增殖活性的作用，并通过提高恶性转化细胞G0／G1期细胞周期比例而影响细胞周期的进程，从而改变恶性细胞的增殖和分化。     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的研究氯化镉诱发SV40 LargeT抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用。方法体外用不同浓度氯化镉多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度。结果细胞培养至35代,发现氯化镉可诱导16HBE恶性转化。转化细胞排列紊乱、重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01),并呈时间—剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论氯化镉有较强的诱导16HBE恶性转化能力;该转化模型为镉致癌机制的分子水平提供了理想的研究系统。     

恶性转化人支气管上皮细胞基因组甲基化观察

目的对反式二氢二醇环氧苯并芘（anti-BPDE）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化人支气管上皮细胞（Hu-man bronchial epithelia,16HBE）基因组DNA甲基化状况进行研究,寻找DNA甲基化异常的基因片段,探讨反式-BPDE和NiS的表遗传致癌机制.方法采用限制性指纹识别技术（MSRF）,对反式-BPDE和NiS分别诱导转化及裸鼠成瘤的4种人支气管上皮细胞株基因组进行分析;对异常甲基化基因阳性片断采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较.结果发现结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞基因组存在高甲基化的DNA片段,其中一基因片段与编码鼻咽癌易感性蛋白ANKRD11基因序列99%同源.另一基因片段与HOXA3基因序列99%同源;未发现反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞基因组DNA异常甲基化基因片段.结论结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞DNA的高度甲基化可能导致基因表达抑制.可能是结晶型NiS致癌的一种表遗传机制;反式BPDE致癌过程可能与基因组磷酸胞苷酰（CpG）岛甲基化异常关系不明确.     

石英诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的 研究石英诱发永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化作用.方法 用新研磨的浓度为300 mg/L的石英染毒16HBE细胞共10次,软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验鉴定转化细胞的恶性程度.结果 细胞培养至35代,发现石英可以诱导16HBE发生恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01);转化细胞在裸鼠体内成瘤.结论 石英具有较强的诱导16HBE恶性转化能力.     

二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析

目的研究苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的基因和蛋白表达的改变,探讨苯并(a)芘致癌的分子机制.方法应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片检测反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因表达谱的变化;应用二维凝胶电泳技术和相应软件ImageMaster2D 3.10分析反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的蛋白质组变化,基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱结合数据库检索鉴定部分表达有差异的蛋白斑点.结果BPDE诱发的恶性转化细胞与阴性对照细胞比较,cDNA芯片结果显示差异表达基因有143条,其中52条基因在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达增高,91条基因在恶性转化细胞中表达降低;二维凝胶电泳显示有72个蛋白斑点出现表达差异,其中44个蛋白斑点在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达升高,28个蛋白斑点在恶性转化细胞中表达降低,对其中7个表达明显差异的蛋白斑点的鉴定显示,原癌基因v-erbb2同源3、锌指蛋白127、硫氧还原蛋白过氧化物酶2、KIAA0471蛋白在恶性转化细胞中高表达,而钙结合蛋白5、锌指蛋白Aiolos、Kelch样蛋白3在恶性转化细胞中低表达.结论反式-BPDE诱发16HBE恶性转化的基因表达谱和蛋白表达谱发生了显著的变化,这些表达改变的基因和蛋白可能参与了BPDE诱发细胞恶变的过程.     

PP2Ac去甲基化在BaP诱导HBE细胞恶性转化中的作用

目的探讨蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化在苯并(a)芘(benzo[a]pyrene,BaP)诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,HBE)恶性转化中的变化及可能作用。方法用40μmol/L BaP处理人支气管上皮细胞,每周一次,共15周,构建BaP诱导的HBE细胞恶性转化模型,采用软琼脂试验和裸鼠成瘤试验鉴定恶性转化是否构建成功,使用蛋白免疫印迹(Western blot)分析比较恶性转化细胞和同期对照组细胞中PP2Ac去甲基化及其调节蛋白表达变化。结果软琼脂试验和裸鼠成瘤试验结果显示,经BaP处理后的细胞能在软琼脂中形成细胞集落,接种BaP诱导转化细胞的裸鼠可见肿块,说明恶性转化成功。蛋白免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达发现,经BaP诱导恶性转化的HBE细胞和经100μmol/L BaP单次刺激24 h的HBE细胞与正常HBE细胞相比,总PP2Ac表达均无差异,亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)表达均明显下降,蛋白磷酸酶甲基酯酶1(PME-1)和PP2Ac去甲基化(Dem-PP2Ac)表达均明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PP2Ac去甲基化在BaP诱导细胞恶性转化中发挥作用,可能通过增强PP2Ac去甲基化促进BaP致肺癌发生。     

二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞转化最佳实验方案

目的　采用客观又简单的软琼脂细胞集落形成率的指标来探索二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞转化的理想实验方案 ,构建恶性转化的细胞模型。方法　根据细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量 ,以不同剂量二羟环氧苯并芘 1次或多次处理细胞 ,观察培养的不同阶段转化灶出现情况 ,用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征 ,比较各组转化细胞的集落形成率。结果　以 0 .1、0 .5、1.0、2 .0 μmol/ L的剂量 ,对细胞多次间断染毒 ,传代 15次 ,是二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞恶性转化的理想方案 ,其集落形成率分别为 2 .0‰、5 .5‰、7.0‰、10 .5‰ ,剂量 -反应关系呈现良好的直线相关 ,r=0 .9741,P<0 .0 5。结论　二羟环氧苯并芘能诱导人支气管上皮细胞 16 HBE转化 ,构建理想的恶性转化的细胞模型     

结晶型硫化镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析

目的　检测结晶型硫化镍对基因组不稳定性的影响 ,从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法　采用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)技术对经结晶型硫化镍在诱导人支气管上皮细胞系 (16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果　本实验所选用的 7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带 ,条带数在 1～ 6条之间。 7条引物中第 4条、第 5条和第 7条两条扩增的片段在实验组和对照组之间无明显差异 ,其余 4条引物均有差异。对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论　结晶型硫化镍能诱发 16HBE细胞基因组不稳定     

硫酸镍诱导的人支气管上皮细胞系癌变细胞基因组不稳定性分析

目的　检测硫酸镍对基因组不稳定性的影响,从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法　采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术对经硫酸镍在诱导人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果　本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带,条带数在1~6条之间。7条引物中第1、4、7的3条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余4条引物均有明显差异,对于同一随机引物它们都具有特异的带型。结论　硫酸镍能诱发16HBE细胞基因组不稳定。     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。     

致癌物诱导恶变细胞中线粒体高变区序列分析

目的检测苯并（a）芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘（反式-BPDE）及结晶型硫化镍（NiS）诱发永生化人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化过程中线粒体DNA控制区序列变化。探讨线粒体DNA控制区在环境致癌物苯并（a）芘及硫化镍致癌作用中是否存在靶分子序列。方法 应用银染PCR-单链构向多态性（SSCP）方法及测序方法分析恶变细胞中线粒体DNA高变区的序列变化。结果 经反式-BPDE和NiS诱导恶变的人支气管上皮细胞系线粒体高变区均未发现异常改变。结论 线粒体基因控制区可能并非是化学致癌物诱发肺癌的靶序列。     

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。     

硫化镍对16HBE细胞中基因的影响

目的 检测结晶型硫化镍(NiS)对K-ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用限制性片段长度多态性分析和聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法探查结晶型NiS在诱导16人气管上皮细胞(HBE)恶变过程中的K-ras基因Exonl第12密码子及第12密码子以外的密码子改变情况。采用PCR-SSCP分析方法探查结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术来对结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果 K-ras基因Exonl和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带。其中P4、P5、P7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异，其余4条引物均有差异。对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论 P15基因第2外显子和K-ras基因第1外显子(包括第12、13密码子)可能不是结晶型NiS作用的靶部位。在结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。     

硫化镍转化人细胞翻译启动因子的异常表达

目的探讨结晶型硫化镍(NiS)在诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶变过程中蛋白质翻译启动因子(TIF3)的异常表达，以阐明不容性硫化镍的人类分子致癌机制。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，以及敏感先进的荧光定量PCR方法，对异常表达的蛋白质翻译启动因子TIF进行检测。结果相对于非转化对照细胞，RT-PCR实验初步显示，这些镍转化细胞和成瘤细胞的TIF3基因表达水平显著升高，平均分别是对照细胞的2和4倍，表明TIF3的异常表达水平与硫化镍诱发人支气管上皮细胞的恶变程度有关。结论不容性结晶型硫化镍在诱发人支气管上皮细胞恶变过程中，存在明显的蛋白质翻译启动因子TIF3异常表达现象，其表达水平与细胞的恶变程度密切相关，可能是结晶型硫化镍诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一。     

硫酸镍对永生化人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的 建立硫酸镍(NiSO4)对永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiSO4对16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒一次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成实验和棵鼠体内致瘤实验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiSO4多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内形成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞瘤。结论 NiSO4具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。