广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

目的：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ,分别采用RT-PCR,5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列,PCR产物克隆到载体并测序,拼接成全基因组序列,分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10 735 nt,两端非编码区（NCR）长度分别为94 nt和462 nt。基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株（GZ01/02,GZ/218/2002）,1995年广东分离株（GD23/95,GD01/95）、1995年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型;而1999年广东分离株（GD05/99）,1997年广东分离株（GD14/97）和1980年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型;另外,71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株（98901530 DF DV-1-ID）的同源性最高。结论：71/     

深圳市登革1型病毒株全基因组特征及系统进化分析

目的对深圳市2014年登革病毒1型(DENV-1)流行株进行全基因序列测定,分析其分子病毒学特征,探讨其可能来源。方法采集2例登革热患者急性期血清标本,用BHK-21细胞培养分离病毒,RT-PCR进行病毒血清型别鉴定,并用RT-PCR进一步扩增全基因组序列,测序后进行同源性比较、系统进化树分析和遗传变异分析。结果 2例深圳DENV-1分离株进行全基因组测序结果显示同源性为100.0%,其基因组全长均为10 735 bp,编码3 329个氨基酸,与新加坡DENV-1流行株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为99.3%和99.7%。全基因组序列系统进化分析显示,深圳DENV-1株为基因Ⅰ型,与Fujian2004、Zhuhai2007和Singpore2008的亲缘关系较近,均在同一进化分支上。与广州DENV-1株GZ/80相比,深圳2014年DENV-1分离株发生了碱基变异430个,氨基酸变异42个,5’UTR存在1处点突变,3’UTR序列共有8处位点发生变异。结论 2014年深圳市DENV-1株可能来源于东南亚一带。病毒在进化过程中出现一些位点变异,这些变异的生物学意义有待进一步研究。     

广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株E基因序列分析

目的测定广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株的E基因序列并进行分析。方法收集广州市2006年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发生树,进行生物信息学分析。结果59份标本中38份病毒分离培养阳性,获得广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2006/1707的E基因序列,其同源性与东南亚缅甸、泰国、柬埔寨等地的流行株接近,但与广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2002/281较远。结论广州市2006年流行的登革病毒属输入性,但与2002年流行的登革病毒有不同的输入源。     

河南省1例柬埔寨输入登革热病例的病原分子分型与全基因序列分析

目的鉴定河南省1例来自柬埔寨的登革热输入性病例的登革病毒(dengue virus,DENV)血清型和基因型及其序列特征和传播来源。方法患者血液标本来源于2019年国家疾病监测系统网络直报的登革热疑似病例。样品经快速检测DENV NS1抗原和IgM/IgG抗体,再提取血清中核酸,应用荧光RT-PCR法进行DENV血清型鉴定,同时用Vero和BHK-21细胞对血清标本进行病毒分离培养,阳性培养物扩增全基因组序列,进行序列系统进化分析。结果该病例实验室确诊为DENV 1型感染,并从血清标本中分离到病毒株,测序后拼接成全长10670 nt的全基因组序列,经系统进化分析,该病毒株属于DENV 1型基因Ⅰ型,与东南亚流行株具有较高同源性和较近亲缘关系。结论2019年河南省来自柬埔寨的输入性病例的病原体为DENV 1型基因I型,此为近年来东南亚输入我国的常见血清型和基因型。     

肠道病毒71型基因组5'非编码区序列分析

目的 了解2009年山东省临沂市分离的肠道病毒71型(EV71)基因组5 '非编码区(5'UTR)序列特征,探讨基因组中引起神经毒性作用的候选位点.方法 从手足口病患者的粪便标本中分离EV71,运用一步法逆转录聚合酶链反应扩增8个病毒株的5 'UTR区,运用DNAstar和MEGA 4软件进行序列分析.结果 8个病毒株5'UTR区核苷酸为741 ～745 nt,核苷酸序列同源性介于97.0％～99.9％,8个病毒株的5'UTR区与C4亚型的同源性最高.序列比对发现,在5'UTR区第265 nt及703 nt处出现了核苷酸的突变(G265A,G703T).遗传进化分析显示,8个病毒株序列与C4亚型的亲缘关系最为密切.结论 此8个病毒株为C4亚型,核苷酸突变(G265A,G703T)可能与EV71的致神经毒性作用有关.     

长沙市柯萨奇病毒A2型和A5型全基因组序列特征分析

目的 了解长沙市柯萨奇病毒A2型（coxsackievirus A2, CV-A2）和A5型（coxsackievirus A5, CV-A5）的序列分子特征及进化趋势。方法 采用二代测序技术获得CV-A2和CV-A5的全基因组序列,进行同源性和进化树分析,使用SimPlot查看毒株序列重组区域。结果 获得长沙市2019年手足口病常规监测病例中CV-A2和CV-A5毒株全基因组序列。CV-A2毒株命名为S281/Changsha/CHN/2019,基因组全长7 422 bp。CV-A5毒株命名为S272/Changsha/CHN/2019,基因组全长7 425 bp。CV-A2全基因组序列与国内CV-A2毒株进行同源性分析发现,非结构蛋白区比结构蛋白区同源性低。CV-A2毒株与原型株Fleetwood（NC038306）相比同源性为79.20%,与湖北省CV-A2毒株（MN419014）同源性最高为95.60%,但非结构蛋白3C和3D区同源性最低,分别为90.51%和92.06%。进化树分析发现3C和3D区位于CV-A4分支。非结构蛋白区新增多个氨基酸突变位点,结构蛋白区氨基酸序列保守。基因重组分析发现CV-A2毒株在3C和3D区存在重组现象。对CV-A5全基因组序列分析发现,与国内CV-A5毒株相比,非结构蛋白区比结构蛋白区同源性低。全基因组序列与CV-A5原型株Swartz（AY421763）相比同源性为80.7%,与澳大利亚毒株（MH111030）相比同源性最高为97.43%,进化树分析发现与MH111030位于同一分支,证明CV-A5为输入型毒株。CV-A5毒株结构蛋白区氨基酸序列保守。结果 长沙市CV-A2毒株为重组毒株,CV-A5毒株为国外输入型。本研究可帮助了解长沙地区CV-A2和CV-A5的全基因组特征,为了解柯萨奇病毒的进化趋势及遗传特征提供理论数据,以便及时有效地阻断疾病传播。     

2014-2019年揭阳市登革病毒E基因序列分析

目的探讨揭阳市登革病毒(DENV)的分子特征并进行生物学溯源。方法收集2014-2019年揭阳市登革热流行期间登革热疑似和临床诊断病例的急性期血清,用实时荧光定量RT-PCR方法检测病毒核酸及分型,阳性标本进行病毒分离及鉴定,扩增并测定部分分离株E基因序列,用生物学软件进行序列比对分析并构建系统进化树。结果 896份急性期血清中DENV核酸阳性556份,阳性率为62.05%;血清型以DENV-Ⅰ为主(534例,占96.04%),其次为DENV-Ⅱ(18例,占3.24%)。序列分析显示,DENV-Ⅰ分离株基因型分属Ⅰ型和Ⅴ型,以Ⅰ型为主;DENV-Ⅱ分离株基因型均属于Cosmopolitan型。DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ分离株与周边地市、珠三角城市及东南亚国家流行株同源性较高。DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ分离株均属于弱毒株。结论 2014-2019年揭阳市登革病毒以血清Ⅰ型基因Ⅰ型为主,其次是血清Ⅱ型基因Cosmopolitan型;推测揭阳市登革热流行毒株多来源于周边地市、珠三角城市及东南亚国家。     

一株急性散发性戊型肝炎病毒基因结构及核苷酸同源性分析

目的：分析一株长春地区散发戊型肝炎病毒（HEV）的基因结构和核苷酸同源性。方法：采用RT-nPCR方法检测HEV RNA，应用全自动测序仪进行序列测定。结果：所获得的HEV-CCC220全长7 193bp，编码2 397个氨基酸，由5′-UTR（nt 1-9）、3′-UTR（nt 7152-7193）和3个开放读码框架（ORF_s）组成。与HEV Ⅳ型核苷酸同源性明显高于HEVⅠ～Ⅲ型，全基因序列核苷酸同源性为83.2 %～85.0%；与ORF₂间300　nt和98　nt部分基因序列核苷酸同源性分别为85.0%～93.9%和80.6%～86.7%。结论：长春地区散发性HEV-CCC220属HEV Ⅳ型，ORF₂间300nt部分核苷酸序列可以代替全基因序列进行HEV基因型分析。     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

西双版纳州2016年登革1型和2型病毒疫情的流行病学调查

目的 了解云南省西双版纳州2016年登革热流行特征和登革病毒血清型、基因型及其传播来源.方法 收集登革热病例资料,采集患者急性期血清标本,用RT-PCR法检测登革病毒核酸,并进行登革病毒C/PrM区核苷酸序列测定和进化分析.结果 2016年西双版纳州共确诊登革热病例53例,其中本地感染病例24例(勐腊县21例和景洪市3例),输入性病例29例(来自缅甸24例和老挝5例).流行月份为7-11月.病例年龄以20～49岁组为主,男女性别比为1.9∶1.蚊媒监测景洪5-10月布雷图指数(Breteau index,BI)为8.4～21,勐腊6-10月BI为7.6～18.2,勐海县9-10月BI为8.4～8.8,其它月份BI均小于5.从患者血清中获得13株登革病毒的C/PrM区基因核苷酸序列,进化分析表明,10株为登革病毒血清型1型(DENV-1)中的基因Ⅰ型(Genotype-Ⅰ,G-Ⅰ),3株为登革病毒血清型2型(DENV-2)的亚洲基因Ⅰ型(Asian genotypeⅠ,AG-Ⅰ),均为东南亚地区的优势基因型.无论DENV-1或DENV-2均与近几年云南省瑞丽市、临沧市和东南亚地区的同型流行株具有较近的亲缘关系.结论 西双版纳州2016年发生了包括本地和输入性病例并存的DENV-1 G-Ⅰ和DENV-2 AG-Ⅰ流行,并证实相邻的缅甸和老挝边境地区存在这两种血清型登革病毒流行,来自缅甸和老挝的输入性病例是引起西双版纳本地流行的主要原因.此为西双版纳首次发生DENV-1和DENV-2 AG-Ⅰ的本地流行.     

两株盖塔病毒全基因组序列测定与分子遗传进化

目的 对2011年和2017年分别在我国甘肃省和海南省分离的两株盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）进行全基因组核苷酸序列测定,分析其与我国1964年首次分离的盖塔病毒（M1）的分子差异及分子遗传进化特征。方法 使用病毒基因扩增技术测定新分离的两株盖塔病毒全基因组核苷酸序列,建立盖塔病毒基因组数据集并使用生物信息学软件进行病毒分子特征及分子遗传进化分析等。结果 两株新分离盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）基因组全长分别为11 690 nt和11 621 nt。两株病毒均具有甲病毒基因组结构特征。虽然两株病毒的结构基因、非结构基因以及非编码的连接区核苷酸序列长度均完全相同,但是病毒基因组5'和3'非编码区的核苷酸序列长度存在差异。两病毒株基因组3'UTR重复序列单元的结构未发生变化。病毒基因组同源性分析结果显示,海南省2017年分离的盖塔病毒（HNDZ1712-1）与我国于1964年首次在海南省蚊虫分离的盖塔病毒（M1）之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为97.7%和98.1%。盖塔病毒全基因组核苷酸序列的分子遗传进化分析结果显示,本研究的两株病毒及其所属病毒株分别形成两个单独的进化簇,甘肃2011年进化簇和海南2017年进化簇,并与1964年海南首次分离的病毒形成完全独立的进化种群。结论 虽然HNDZ1712-1病毒同样分离自海南岛蚊虫标本,但是与1964年海南岛分离的病毒（M1）处在完全不同的进化分支,而与数千公里之外的甘肃省分离株（GS11-155）具有较近的进化关系,提示新分离的两株盖塔病毒与1964年分离的盖塔病毒存在较大分子遗传差异。     

vpr基因在GFP荧光基因转染SHIV病毒模型中的作用

【目的】通过在vpr基因区不同部位插入EGFP基因,探讨vpr非结构基因的改变对SHIV病毒复制及感染能力的影响。【方法】利用分子克隆的方法,将EGFP基因插入SHIV基因组中的调节基因vpr基因中,最终获得相应的SHIV XJDC6431-EGFP全长克隆,然后在细胞水平检测该病毒感染活性及荧光蛋白表达情况。【结果】通过定点突变及在vpr基因不同部位插入GFP报告基因,检测改造后的质粒虽表达绿色荧光,但经细胞水平检测后均来得到具有感染活性的病毒颗粒。【结论】vpr基因定点突变可使全长SHIV病毒复制大大降低,共至失去感染活性。     

霍乱弧菌O139群CTXφ和nct-CTXφ基因组共存新型结构

目的霍乱孤菌（VC）O139群CTXφ和nct—CTXφ基因组共存新类型的结构研究。方法分别扩增CTXφ或nct—CTXφ基因组串联体的第一个基因组末端和第二个起始端之间的基因,扩增片段再经RsaⅠ和BglⅡ酶切、型特异引物PCR方法,区分rstR—ig2类型;扩增TLC和RS区之间片段并区分rstR—is2类型;扩增RTX与CTXφ或nct—CTXφ核心区之闻片段。结果O139群VC代表菌株及CTXφ和/或nct—CTXφ的rstR—ig2类型（以上标表示）如下,FJ9510株CTX ETφ、FJ98352株CTXETφ＋nct-CTXφ＋nct-CTX calcφ、FJ99364株CTXETφ＋nct-CTX newO139φ＋nct-CTX calcφ、JS9803株CTXETφ＋nct—CTX newO139φ、JX94484株CTXETφ＋nct—CTX newETφ;不同rstR—ig2类型CTXφ和nct—CTXφ基因组zot基因3’末端46bp序列中20个位点不同,推测的15个氨基酸序列中11个位点不同;O139群VC CTXφ基因组附近序列均为TLC和RTX基因簇,而nct—CTXφ基因组附近均为未知或新类型序列。结论阐明O139群VC CTXφ和nct-CTXφ基因组共存新类型主要变异区及染色体插入位点附近结构。     

HBV-DNA高水平孕妇的HBV 前S和S区基因突变及基因分型

 【目的】 研究HBV-DNA高水平孕妇的HBV前S(前S1和前S2)及S区的基因突变模式和基因分型,为从病毒因素探讨HBV母婴传播免疫阻断失败提供实验基础。【方法】 选取血清HBsAg阳性且HBV-DNA≥105 IU/ mL的孕妇41 例,提取血清HBV-DNA,靶向设计HBV各基因型的前S及S区通用引物, 经PCR 扩增测序进行序列分析, 检测和分析前S及S区基因的突变情况,并进行基因分型。【结果】 ①在 41 例样本中, 共有29例( 70.73%)样本存在前S1、前S2及S区基因突变,突变方式以碱基置换为主;前S1、前S2及S区基因的突变频率分别为8.96%、9.88%和3.24%,前S1和前S2区的突变频率显著高于S区(P < 0.05)。②对41例样本根据S区点突变的特点进行基因分型及同源树簇集分析,结果B基因型22例,C基因型19例,两基因型在全S区的基因突变频率相比,差异无统计学意义(P > 0.05);B、C两基因型分别形成独立的簇集,簇集间同源性<90%,但簇集内B、C两个基因型的同源性分别达96%和95%。【结论】 ①HBV-DNA高水平孕妇的HBV 前S及S区的基因突变普遍存在,突变形式以碱基置换为主,突变频率以前S1和前S2区常见,S区则相对稳定;②不同HBV基因型间同源性差异较大,按HBV不同基因型分别进行前S和S区基因突变模式的分析将更有意义。     

转基因植物表达质粒中SBR基因的序列分析

【目的】对转基因植物表达质粒pROP1中含SBR基因P1片段（184～1946bp）进行序列测定和分析。【方法】从E.coliDH5α中提取质粒pROP1,用PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪检测P1片段的序列,并与GenBank上的变形链球菌表面蛋白基因序列比较,检测其准确性。【结果】测定了P1片段5′端616个碱基序列和3′端466个碱基序列,其准确性达98％。【结论】PCR扩增的P1片段5′端和3′端的DNA序列与变形链球菌表面蛋白pac基因唾液粘附区相一致,为转基因番茄防龋疫苗的研究提供了基础资料。     

肠道病毒71型山东分离株全基因组序列分析

目的 探讨2008年山东省流行的肠道病毒71型(EV71)的基因特征。方法 以2008年山东省分离的一株EV71(JN200804)为样本,采用RT-PCR方法扩增并测定全基因组核苷酸序列,进行同源性比较和种系发生分析。结果 JN200804株的全基因组序列长度为7404个核苷酸,与其他EV71毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,5′ UTR和3′ UTR的长度和序列有差异。核苷酸同源性比较结果表明,JN200804株与安徽株(Fuyang/17.08/1)、浙江株(Zhejiang08)和北京株(BJ08)的核苷酸同源性均大于95%,与国际标准株BrCr的同源性仅为79.8%。氨基酸同源性比较结果表明,JN200804株与Fuyang/17.08/1同源性高达99.6%,与TW/2086/98同源性最低(94.5%)。根据P1、P2和P3区基因序列构建了种系进化树: JN200804株与C4亚型各毒株(Fuyang/17.08/1、Zhejiang08、BJ08、SHZH03、N3340-TW-02和SHZH98)同属一个分支,核苷酸同源性都在91%以上。结论 JN200804株属于EV71的C4亚型,与AnhuiFY08、Zhejiang08和BJ08的进化关系最为密切。