共查询到20条相似文献,搜索用时 296 毫秒
1.
设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因,并融会了RGD3肽编码序列,通过连接、克隆、酶切筛选、DNA序列分析,得到真核表达质粒pAPR-HD,表达质粒转染CHL细胞,经G418筛选,获得表达克隆。结果:细胞培液中,重组水蛭素衍生物的活性达到10ATU/ml,并有抗血小板凝集作用。结论:水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景,但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。 相似文献
2.
制备水蛭素衍生物,首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序,设计了水蛭素的基因,基因中融合了RGD三肽编码顺序,形成水蛭素衍生物编码基因,用DNA合成仪,分10个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中6个寡核苷酸组成外端大片段,4个寡核苷酸组成C-端大片段。各大片段与载体pUC19重组和无性繁殖后,通过KpnⅠ位点连接成编码水蛭素衍生物分子的完整基因。经核苷酸顺序分析证实后,水蛭素衍生物基因与表达载体重组,转化大肠杆菌,筛选含重组质粒的细菌,命名为pSGHRE。结果:pSGHRE菌破碎后,上清和沉淀部分都有水蛭素活性。上清活性约20ATU/ml菌液。结论:我们构建了水蛭素衍生物基因的克隆并在大肠杆菌中得到表达。 相似文献
3.
目的:利用DNA重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭素基因。方法:将水蛭素变体1的基因HV1克隆到pEZZ318表达载体,转化E.coliJM109菌株,IPTG诱导表达,培养上清液经SDS-PAGE凝胶电泳检测,hIgG-agarose亲和层析纯化。结果:表达的融合蛋白相对分子质量为20kD,表达上清的抗凝血酶活力为47ATU(AntithrombinUnit)/ml。结论:在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑制作用 相似文献
4.
水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:利用DNA重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭不基因。方法:将水蛭素变体1的基因HV1克隆到pEZZ318表达载体,转化E.coliJM109菌株,IPTG诱导表达,增减上清液经SDS-PAGE凝胶电泳检测,hIgG-agarose亲和层析纯化。结果:表达的融合蛋白相对分子质量为20kD,表达上清的抗凝血酶和为47ATU/ml。结论:在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑 相似文献
5.
目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础. 相似文献
6.
水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:7,自引:0,他引:7
制备水蛭素衍生物,首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序,设计了水蛭素的基因,基因中融合了RGD三肽编码顺序,形成水蛭素衍生物编码基因,用DNA合成仪,分10个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中6个寡核苷酸组成N-端大片段,4个寡核苷酸组成C-端大片段。 相似文献
7.
8.
水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达,以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体I(HV1)的氨基酸序列,选择酿酒酵母偏爱的密码子,设计了HV1基因。将HV1基因分12个寡核苷酸片段,进行人工合成,并连接成一个完整的水蛭素基因。经PCR扩增后,将扩增产物连到克隆载体pBS-SK(+)上并进行DNA序列分析。用正确的HV1基因与酵母α因子信号肽基因相连,并一起插入酵母表达载体pYC-DE,经鉴定表明,获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母BJ1990细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中,检测出的水蛭素活性为30抗凝血酶单位(ATU)/ml。所表达的量高于HV2在酵母中和HV1在原核系统的表达水平。N末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的HV1基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。 相似文献
9.
目的 构建血小板衍化内皮细胞生长因子(PD-ECGF)的原核表达载体。方法 设计引物扩增PD-ECGF的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE和pQE-32a,并转化入大肠杆菌JM109。结果 通过菌落原位杂交、PCR和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆。结论 此重组质粒可用于原核表达等进一步研究。dir 相似文献
10.
目的:构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA的重组质粒。方法:利用化学合成引物,进行PCR,对人G-CSFcDNA5'AUG侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后,重组入表达载体pED,构建成质粒pED-GCSF,用DEAE-Dextran法转染COS7细胞,ELISA法定量测定rhG-CSF表达水平。结果:转染COS7细胞后48h收集的上清rhG-CSF表达量为52ng/ml,72h为230ng/ml,显示rhG-CSF获得了暂时性高表达。结论:pED-GCSF是一个能在哺乳动物细胞中高效表达rhG-CSF的真核表达质粒。 相似文献
11.
人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化、鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
用 Hind Ⅲ和 Eco RⅠ双酶酶切经改造的 P U Ca F G F质粒,获得了人酸性成纤维细胞生长因子(ha F G F)基因,将该基因片段插入表达载体pkk2233,筛选得到了重组质粒pkkha F G F。加 I P T G 诱导该质粒转化的大肠杆菌 J M 109 表达,ha F G F在发酵液中的表达水平约80m g/ L。用肝素亲和层析的方法,获得了电泳纯ha F G F样品。纯化过程中ha F G F活力回收率为65% 。纯化ha F G F样品的比活性为 E D50 4.6ng/m l,理化及生物活性分析与天然ha F G F对照品完全一致。 相似文献
12.
13.
甲醇酵母(Pichia pastoris)是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人Cu,Zn-SOD基因克隆到酵母整合型质粒载体pPIC3.5K,经转化his4缺陷型酵母GS115,用MD培养基及PCR方法筛选阳性转化子,并用含G418的YPD培养基筛选多拷贝转化子,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人Cu,Zn-SOD,经计算机扫描分析,表达量占酵母可溶性 相似文献
14.
目的:构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA的重组质粒。方法:利用化学合成引物,进行PCR,对人G-CSFcDNA5AUG侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后,重组人表达载体pED,构建成质粒PED-GCSF,用DEAE-Dextran法转染COS7细胞,ELISA法定量测定rhG-CSF表达水平。结果:转染COS7细胞后48h收集的上清rhG-CSF表达量为5 相似文献
15.
16.
目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。 相似文献
17.
18.
运用DNA重组技术,将用RT-PCR方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白319个氨基酸的核苷酸序列导入载体pBluescript和表达载体pGEX中,分别构建了重组质粒pBSK9RAP和pGEX-9RH7,转化入大肠杆菌XL1-Blue和DH5α中,经IPTG,x=gal抗生素筛选阳性克隆,扩增后,重组质粒用限制性内切酶图谱分析及DNA测序分析,证明插入了方向正确,表达阅读框架正确。 相似文献
19.
基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究 总被引:1,自引:0,他引:1
利用基因重组技术,成功地构建了MDR I基因片断的表达载体pGE-Hmdr-1,用氯化钙方法转化E.coli HB101,挑选20个克隆扩增培养,经提质粒,酶切,Agarose电泳检测证实:其中4个克隆含有重组质粒,选用含重组质粒载体的菌株扩增培养,经IPTG诱导,超声波破碎,抽提蛋白,GSH-agarose亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳检测证实:此重组载体已表达所需的目的蛋白(GST-mdr 相似文献
20.
目的 克隆与结核分支杆菌耐异烟肼密切相关的KatG基因,实现其在大肠杆菌中的表达并对其酶活性进行初步检测。方法 构建含KatG基因的表达质粒pET24b-KatG,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得稳定的高表达菌株后对表达产物进行过氧化氢酶活性的初步检测。结果 限制性内切酶分析结果显示所构建的pET24b-KatG表达质粒已成功克隆了KatG基因。含pET24b-KatG表达质粒的大肠杆菌在 相似文献