溶氧对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制

目的 探索溶氧对L-天冬酰胺酶发酵过程的影响及其控制方法。方法 通过装液量试验、接种量试验、葡萄糖试验和氧载体试验,考察摇瓶发酵过程中溶氧对L-天冬酰胺酶合成的影响,采用通纯氧自控pH的发酵工艺进行溶氧控制和pH控制。结果 采用通纯氧自控pH的发酵工艺,可延长发酵周期,有效防止菌体过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83％,达到110u/ml。发酵动力学特性分析表明,该发酵方式L-天冬酰胺酶的合成与菌体生长不相关,控制比生长速率μ为0.15～0.301/h,均有利于L-天冬酰胺酶的合成,可使Qp_(max)达到3922mmol/g.h。结论 溶氧对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的合成有严重影响,已建立了控制溶氧的发酵工艺。     

~(15)N标记L-天冬酰胺的合成

以L-天冬氨酸作为手性源,采用先选择性酯化后再氨解的方法,制备得到15N标记L-天冬酰胺。对影响反应收率的多种因素如酯化催化剂种类、氨解温度、反应时间和氨用量等进行了考察。结果表明,在POCl3作为酯化催化剂,n(NH3)/n(L-天冬氨酸-β-甲酯)=7,反应时间60 h和反应温度为50°C条件下可获得良好的L-天冬酰胺收率。产物经旋光仪、HPLC、红外、质谱和元素分析等证实,合成过程未发生消旋化和同位素丰度稀释现象。     

用双水相系统释放大肠杆菌L-天门冬酰胺酶

引　言Ｌ 天门冬酰胺酶 (ＥＣ3 5 1 1)能催化Ｌ 天门冬酰胺水解为Ｌ 天门冬氨酸和氨 ,是治疗白血病的药物 .目前Ｌ 天门冬酰胺酶主要由微生物发酵生产 ,属于胞内酶 .传统的提取纯化Ｌ 天门冬酰胺酶的过程包括制备丙酮粉和缓冲液萃取[1] .这种方法要使用大量的丙酮 ,产生细胞碎     

除草剂靶酶-天冬酰胺合成酶特性及其抑制剂的研究进展

天冬酰胺合成酶是2000年发现的除草剂环庚草醚靶标酶,在植物体中,天冬酰胺合成酶是催化天冬氨酸和谷胺酰氨生成天冬酰胺和谷胺酸,而天冬酰胺义是重要的运输氮化合物。现义明确天冬酰胺合成酶是由两部分组成：N基末端的两个反平行式β-折叠片层巾的楔形部分是负责水解谷氨酰胺的活性部位;C基末端负责结合Mg^2＋ATP和天冬氨酸。在芳香族植物巾发现单萜化合物有抑制天冬酰胺合成酶的作用,化学合成1．4-桉树脑衍生物也有一定除草活性。     

（叔丁氧羰基）-L-天冬酰胺的合成研究

研究了（叔丁氧羰基）-L-天冬酰胺的合成,并对该工艺条件进行了方法学研究。L-天冬酰胺、氢氧化钠和二碳酸二叔丁酯溶于水和1,4-二氧六环中,在20℃下反应12h。该工艺方法得到84%的收率,且反应条件简单温和,工艺设备成本廉价,实现了操作简单、经济实惠和绿色环保的目的。     

杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究

杂色云芝发酵液,经超滤、DEAE-Sephadex A250柱层析两步分离、纯化出两型漆酶。以愈创木酚与酶带在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带。两型漆酶分别命名为LacA和LacB。经测定两漆酶亚基的分子量分别为66.0kDa和30.7kDa;等电点pI分别为4.79和5.18;LacA的最适作用温度是40℃,LacB为50℃;保温2h, LacA的半失活温度为60℃,LacB为90℃;LacA和LacB催化愈创木酚的酶活最适pH值均为4.0; 二者的稳定pH值也都在2.5~5.5之间。LacA催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为286.5molL-1和292.4nmol mL-1 min-1;LacB催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为813.0mol L-1和127.4nmol mL-1 min-1。     

固定化L-天门冬酰胺酶的性质及其填充床反应器的研究

利用海藻酸钙包埋、戊二醛交联的方法对L-天门冬酰胺酶进行固定化。研究了固定化L-天门冬酰胺酶的最适pH、最适温度、米氏常数、半衰期等酶学性质,并考察了影响固定化酶柱式填充床反应器转化率的因素。结果表明:固定化酶最适pH值为8.5,最适温度为67°C,固定化酶的米氏常数Km增大,固定化酶半衰期随着温度的增加而逐渐减小;温度、反应柱内径、底物溶液浓度、流速等因素对填充床反应器转化率均有显著影响。     

双酶偶联生物合成L-酪氨酸

多酶偶联催化是酶法制备手性药物中间体的重要方法之一。该文采用双酶偶联体系,利用天冬氨酸转氨酶全细胞催化L-天冬氨酸转氨至苯丙酮酸,生成L-苯丙氨酸,同时得到中间产物丙酮酸;反应体系中的酪氨酸酚裂解酶全细胞催化丙酮酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。经考察确定了双酶偶联反应的最佳条件为:温度40℃,pH=8.5,底物苯丙酮酸质量浓度为25 g/L,苯丙酮酸与L-天冬氨酸摩尔比1∶1.2,天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶细胞质量比1∶1,4 mmol/L PLP,0.1 g/L吐温80。30 g/L的氯化铵对双酶偶联反应有促进作用。双菌双酶偶联生物法合成L-酪氨酸,充分利用了反应副产物丙酮酸得到附加值较高的产品,对资源合理利用及绿色合成工艺具有参考意义。     

色氨酸酶重组基因表达及其酶法合成L-色氨酸

为实现色氨酸酶高效、低成本催化合成L-色氨酸,利用p ET30a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的色氨酸酶,以丙酮酸、吲哚和氨为底物,探究其酶学性质,考察了反应温度、起始p H、底物摩尔比对酶促反应的影响,并利用丙酮酸发酵液为底物酶法合成L-色氨酸。结果表明,色氨酸酶重组表达成功,色氨酸酶最佳反应条件为:温度35℃,起始p H=9.0,底物摩尔比n(吲哚)∶n(丙酮酸)=0.6∶1,底物丙酮酸浓度为0.17 mol/L。利用重组色氨酸酶全细胞催化100 m L浓度为0.57 mol/L丙酮酸发酵液,流加浓度为4.27 mol/L吲哚酒精溶液6.5 m L,反应28 h后,L-色氨酸浓度达0.25 mol/L,吲哚摩尔转化率达91.8%。     

微生物酶分离纯化研究进展

在对常规的微生物酶分离纯化方法如沉淀法、疏水层析、凝胶过滤、离子交换层析及亲和层析等的特点、原理及应用进行介绍的基础上,概述了膜处理技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等新颖微生物酶分离纯化技术。指出常规方法和新颖方法的结合为微生物酶带来了高效的分离纯化效果,开发先进、灵活的蛋白质化学技术分离纯化天然酶、重组酶、人工模拟酶及杂合酶势在必行。     

HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

大肠杆菌肉碱脱水酶基因的克隆、测序及高效表达

［摘 要］目的 克隆并表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB，测定其DNA序列，将caiB基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET－28a（＋）中，构建表达质粒pETCaiB，转化大肠杆菌BL21（DE3），用1mmol/L异两基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果 克隆得到的肉碱脱水酶编码基因 caiB长度为 1221bp，与文献报道值相比,DNA序列有26个不同，氨基酸序列只有一个不同，即302位的丙氨酸变为苏氨酸。重组菌经IPTG诱导，可高效表达，SDS－PAGE分析表达蛋白相对分子质量约43000，表达产物含量占菌体总蛋白45％以上。结论 得到了高效表达肉碱脱水酶的重组菌，为制备L-肉碱创造了条件。     

木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建木瓜凝乳蛋白酶(CP)的表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法从生番木瓜中提取mRNA后进行反转录,得到木瓜凝乳蛋白酶的cDNA,PCR产物克隆到pET22-b(+)载体中,重组质粒转化至大肠杆菌BL21,进行诱导表达及表达产物的检测。结果表达产物的SDS-PAGE显示单一条带,相对分子质量约为26000。Western blot表明表达产物可与抗木瓜凝乳蛋白酶特异性抗体结合。结论CP基因已成功在大肠杆菌中克隆表达,为进一步纯化和动物实验奠定了基础。     

耐药大肠杆菌的致病性与免疫原性

目的了解大肠杆菌耐药株的致病性与免疫原性。方法临床分离耐药大肠杆菌,经适宜条件培养后接种小鼠,观察耐药菌株对小鼠的致病性;并选择已知血清型的不同耐药谱和不同耐药水平的菌,分别培养至对数生长期,经甲醛灭活后免疫小鼠,2周后分别用致死剂量的原菌株和同期分离菌株进行攻毒,考察耐药菌株免疫原性。结果24株耐药菌普通肉汤培养物分别感染小鼠,在接种后18h,存活率仅为4%。只有2株菌在1周内仍不能将小鼠全部致死,经小鼠体内传3代后,可在18h内致死小鼠。耐药谱广的菌株感染的小鼠,心肌发生颗粒变性、局灶性出血、坏死;肝脏糖元溶解,脂肪变性;脾脏轻度淤血,淋巴细胞减少;肾脏出血,肾小球肾炎,上皮细胞颗粒变性,水泡变性。而耐药种类少的菌株与对照敏感菌株感染的小鼠主要特征为脾脏出血、淤血,坏死,脾小体消失;肠上皮细胞坏死、脱落、卡他性肠炎。免疫小鼠以免疫用菌株攻毒,均可得较高的保护率,最低为75%,最高为100%。免疫小鼠用非免疫菌株攻毒,小鼠感染后症状出现较缓慢,在18h后出现死亡高峰。耐药种类少的菌株免疫小鼠,对同期分离的非免疫用的致病性大肠杆菌攻击的保护率偏低,而对受试的11种抗生素耐受7种以上的菌株免疫小鼠后,对致病大肠杆菌攻击的保护率显著提高,多数达到75%以上,经统计学分析差异显著。结论耐药大肠杆菌具有较强致病性,且耐药特性与其免疫保护效果相关,多重耐药株对当前流行菌株具有更好的免疫保护作用。     

大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的克隆与表达优化

为了在大肠杆菌中表达大肠杆菌丙酮酸脱氢酶,用PCR法从大肠杆菌总DNA中克隆了pdc基因,将其插入载体pGEX-KG后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现了表达.通过对表达条件的优化,在TB M9(1∶1)培养基中,33℃下使用终浓度0.5 g·L-1的乳糖诱导4 h,重组大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的表达量可占全菌蛋白的45%左右,比未优化前提高了约20%,同时大大降低了成本.     

Dynamic control of arabinose and xylose utilization in E. coli

The common bacterium Escherichia coli (E. coli) can utilize the pentose sugars arabinose and xylose for growth and energy. When fed both these sugars, the bacterium preferentially utilizes arabinose and only when all the arabinose is exhausted from the media does it start to use xylose. This hierarchical utilization of the two sugars is dictated by two proteins: AraC and XylR. These proteins act as controllers of sugar utilization and dictate the timing and rate of utilization of these sugars. While the biochemical interactions defining individual arabinose and xylose utilization systems are well understood, it is not completely understood how the hierarchical utilization is maintained by the bacterium, and how the regulatory crosstalk between the two systems facilitates this hierarchy. To help answer these questions, in this work, we systematically experimentally characterize the regulatory crosstalk between the two sugar utilization systems. Our work demonstrates extensive interaction between the two sugar systems. Specifically, data from our experiments suggest that the xylose system can regulate arabinose gene expression and consequently, cellular physiology dynamically via promiscuous transport and maybe through cross interactions between regulator and non‐cognate sugar. Put together, we demonstrate that arabinose and xylose utilization networks exhibit an example of distributed control in a biological system. This design likely ensures that the system does not fail under perturbations (mutations). Our results help understand multi‐process control in biological systems and bring to light design criteria for synthetic biology applications.

     

分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵

目的　研究葡萄糖剂补加策略 ,以获得大肠杆菌的高密度发酵和人生长激素 (HGH)的高表达。方法　采用批式发酵和补料批式发酵方式 ,葡萄糖的补加采用逐渐增加的方式 ,包括pH、DO和浓度控制。结果　获得HGH的表达量为 30 0mg/L ,光密度达到 12 4(A60 0 )。结论　在大肠杆菌中表达异源蛋白时 ,葡萄糖的补加方式是关键因素 ,补料批式发酵要优于批式发酵     

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定。方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株。结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上。Western blot分析显示重组Lep-tin具有免疫学活性。结论已获得高效表达Leptin的重组菌株。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。