牛乳中乳过氧化物酶的分离纯化技术

牛乳经离心脱脂、酶凝乳除酪蛋白后,通过强阳离子交换色谱分离纯化得到乳过氧化物酶,利用考马斯亮蓝、SDS-PAGE定性定量检测.结果表明：每毫升牛孔能提取乳过氧化物酶0.027 mg,纯度为97%.     

猪肌内脂肪前体细胞分离培养和成脂诱导分化研究

为建立猪肌内脂肪前体细胞分离培养方法,为后续进行猪肌内脂肪沉积相关基因功能研究提供细胞模型,本研究采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法分离猪肌内脂肪前体细胞,通过诱导分化成功诱导出脂肪细胞,并进行油红O染色和甘油三酯含量检测。结果表明:采用胰酶消化结合细胞差速贴壁法能够成功分离出猪肌内脂肪前体细胞并稳定传代,获得的细胞纯度高,增殖和分化能力旺盛,具有典型特征的肌内脂肪前体细胞,冻存活率达90%以上;油红染色及甘油三酯含量检测结果显示,诱导分化第3天细胞内开始形成脂滴,第9天脂质沉积达高峰,继续培养至12 d甘油三酯含量增加不明显。综上,采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法能够获得稳定的猪肌内脂肪前体细胞,可为后续的基因功能分析提供实验素材。     

猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

猪骨骼肌是动物机体重要的运动组织及人类主要的肉食来源,也是研究肌肉生长发育和疾病的良好模型。猪出生后,骨骼肌的生长发育、损伤修复都需要肌卫星细胞的参与,体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞是深入研究骨骼肌生长发育及疾病发生机理的基础,是在细胞水平进行分子功能验证的前提。随着肌肉发育和病理分子机制研究的不断深入,猪骨骼肌卫星细胞的体外分离培养技术也迅速发展起来。背最长肌、后腿肌和半腱肌常用于分离骨骼肌卫星细胞,1日龄猪背最长肌的分离效果最好。常用于分离骨骼肌卫星细胞的酶包括链酶蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等,各酶及酶联合消化的时间不同,最优的过滤方式是200目+400目联合过滤,3次离心法可获得纯度较高的细胞。常使用的培养基为DMEM/F12+10%胎牛血清(FBS)+1%青-链霉素(P/S)。骨骼肌肌卫星细胞常见标记物有配对盒基因3(PAX3)、PAX7、生肌决定因子5(Myf5)、Myf4、肌分化因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)等。作者通过对猪骨骼肌肌卫星细胞的分离、培养及鉴定等方面进行综述,梳理出各步骤中最佳参数,为建立规范猪骨骼肌卫星细胞分离程序提供参考,以期为肌肉发育和疾病研究提供理论及技术支持。     

双峰驼乳乳铁蛋白的分离纯化研究

试验以阿拉善双峰驼初乳为研究对象，经离心脱脂、酸沉淀去除酪蛋白并用硫酸铵经2次盐析获得乳铁蛋白粗提物，再通过Sephadex G-100凝胶层析进行纯化。利用考马斯亮蓝和SDS-PAGE电泳定性定量检测。结果表明，乳铁蛋白分子量为81．42kD，每毫升驼乳中能提取乳铁蛋白约0．86mg，纯度可达90％以上。     

共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

本试验旨在研究共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。试验分离培养了猪骨骼肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞,2种细胞分离培养鉴定后,接种于Transwell细胞小室共培养板进行共培养,待细胞密度达到90%以上分别进行诱导分化。骨骼肌卫星细胞诱导分化8 d后,检测肌内前体脂肪细胞分化水平、分化标志基因的表达以及脂质代谢关键酶的表达。结果显示:与肌内前体脂肪细胞单独培养相比,共培养体系内肌内前体脂肪细胞的脂滴数量和脂滴面积极显著减少(P0.01),肌内前体脂肪细胞增殖分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ和CCAAT增强子结合蛋白的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01),肌内前体脂肪细胞的乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01)。由此可见,共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积具有抑制作用。     

囊尾蚴病猪血清抗体的制备及其相对分子量的测定

用盐析法初步分离囊尾蚴病猪血清中的抗体,用离子交换柱色谱,凝胶过滤层析进一步分级分离纯化,并用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗体的组成。应用１０％连续凝胶系统,圆盘电泳,考马斯亮蓝染色测定相对分子量。     

miR-145-5p靶向IGF1R介导AKT通路抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-145-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),每个处理3个重复,利用qRT-PCR、EdU和CCK-8方法检测增殖相关基因表达量、EdU阳性细胞数和细胞增殖活性;待猪骨骼肌卫星细胞分化后利用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色方法探究分化相关基因mRNA和蛋白水平及肌管形成情况;采用双荧光素酶试验、qRT-PCR和Western blot探究miR-145-5p对下游IGF1R和AKT通路的影响。结果显示,miR-145-5p基因在肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之(P<0.05);随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高(P<0.05)。在猪骨骼肌卫星细胞体外培养过程中,转染miR-145-5p mimi...     

布鲁氏菌脂多糖抗原纯化效果的比较

在纯度、产率、活性等方面比较了硫酸铵沉淀法、冷甲醇二次沉淀法、酶消化处理法纯化脂多糖(LPS)的效果.考马斯亮蓝染色和琼脂糖凝胶电泳定性分析结果证明酶消化处理和冷甲醇二次沉淀纯化的LPS纯度相近;酶消化处理LPS的产率较高;iELISA活性检测结果比较显示酶消化处理纯化的LPS活性较高,且纯化的全过程活性没有下降.重复性试验结果显示酶消化处理提纯方法的可重复性良好.     

旋毛虫肌幼虫可溶性抗原、排泄分泌抗原的电泳分析

本文报道了应用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦（ＩＥＦ）电泳及二维电泳（ＩＥＦ／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）对旋毛虫肌动虫排泄分泌（ＥＳ）抗原和肌幼虫可溶性抗原的分析结果。肌幼虫ＥＳ抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后用考马斯亮蓝染色蛋白质，结果显示１６条蛋白带，分子量范围２１～８０ＫＤ，其中主带９条。ＩＥＦ电泳后分别用ＰＡＳ染多糖、考马斯亮蓝Ｒ－２５０染蛋白质、Ｎｉｌｅ＇ｓ蓝染脂、醋酸ａ－萘酯／坚固蓝染酪酶同工酶，结果肌幼虫ＥＳ抗原分别显示１６，２６、７及０条带；肌幼虫可溶性抗原分别显示２１、３８、４及１１条带。二维电泳后用考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色多肤斑点，结果ＥＳ抗原显示多肽斑点６１个；肌幼虫可溶抗原显示１２２个多肽斑点。     

新桃源猪肌肉化学特性及显微结构研究

对新桃源猪背最长肌肌肉组织显微结构观测结果：肌纤维直径４０．３２±２．３３μｍ、肌纤维密度４０３．６０±３９．５Ｎ／ｍｍ２。红肌纤维占１０．２８％,肌肉的肌内脂含量３．９５％。干物质２６．９３％。新桃源猪与长白猪肌纤维直径、密度、肌纤维、构成比例、肌肉脂上均存在显著差异;肌肉组织中肌肉脂的含量差异亦显著。研究结果表明：新桃源猪肌纤维直径小、密度大,肌纤维构成中红肌纤维所占比例较大,肌内脂肪含量高,肉质细嫩多汁。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell，BSSC），并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC，使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC，使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力，使用2%马血清诱导其分化为肌细胞，RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现，分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形，细胞形态饱满，折光性强，随着培养时间的延长，细胞由原来的无序生长变为有序生长；RT-PCR检测发现，BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达；免疫荧光染色及Western blotting结果显示，PAX7和MyoD基因均呈阳性表达；成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现；成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后，而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上，本研究成功分离获得BSSC，并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

不同日龄东北民猪与大白猪背最长肌游离水和肌内脂肪含量的测定

研究测定了60、120、150、180、210日龄东北民猪与大白猪背最长肌游离水和肌内脂肪的含量,结果显示,120日龄大白猪背最长肌游离水含量极显著高于东北民猪1.25个百分点(P0.01),而210日龄东北民猪极显著高于大白猪2.27个百分点(P0.01),其他阶段无显著差异;60日龄东北民猪肌内脂肪含量极显著高于大白猪1.08个百分点(P0.01),180日龄东北民猪肌内脂肪含量显著高于大白猪0.94个百分点(P0.05),其他日龄无显著差异。上述结果表明,东北民猪背最长肌内游离水含量随着机体生长逐渐接近并超过大白猪,而大白猪背最长肌肌内脂肪沉积开始较晚,随着机体生长肌内脂肪含量逐渐接近东北民猪。     

日粮中添加能量和脂肪对猪脂肪酸含量、瘦肉率和脂肪生成的影响

试验采用40头去势大白公猪,研究日粮脂肪来源(日粮中含有5%的牛羊油或豆油)对猪脂肪酸含量、瘦肉率和脂肪生成的影响是否依赖于日粮可消化的能量浓度(8.8MJDE/kg、14.0MJDE/kg)。试验猪分为4组,体重27-105kg定量饲喂(170g×BW0.569/d)。测背膘、网膜脂、背最长肌中肌间脂肪组织脂肪酸含量和成脂酶活性。试验结果表明,猪生长性能和胴体品质受日粮能量水平影响(p<0.01)与脂肪来源无关。在低能量组胴体脂肪沉积少、成脂酶活性降低(p<0.01)。在日粮能量水平范围内,采食含豆油的     

不同品种猪背最长肌风味物质的研究

本研究选择肉质优良地方品种金华猪、金华猪与引进瘦肉型猪杂交品种以及国外瘦肉型品种大约克等,屠宰测定其背最长肌中肌苷酸、肌内脂肪以及氨基酸含量,探讨不同品种对肌肉风味物质以及营养价值的影响。结果表明:地方品种金华猪背最长肌肌苷酸含量显著高于国外瘦肉型品种和杂交品种(P0.05),肌内脂肪酸含量则是极显著高于其他品种(P0.01);在测定7个猪品种背最长肌的16种氨基酸中除亮氨酸外,品种间差异显著或极显著;金华猪背最长肌中16种氨基酸、氨基酸总量、鲜味氨基酸、必需氨基酸以及必需氨基酸占氨基酸总量的比值均高于国外瘦肉型品种大约克;杜洛克×金华和长白×金华的氨基酸总量、鲜味氨基酸、必需氨基酸均高于金华猪,但是3个品种间差异不显著(P0.05);7个品种中杜金×长大猪的谷氨酸含量为最高,显著高于长×大猪(P0.05),极显著高于其他品种(P0.01)。     

长白山野杂猪和商品猪骨骼肌组织学特性的比较研究

为了探讨长白山野杂猪和商品猪肉质特点及差异,以长白山野杂猪和商品猪半腱肌、背最长肌、股二头肌和腰大肌为试验材料,采用常规组织化学染色方法,对长白山野杂猪和商品猪骨骼肌组织学特性进行比较研究。结果显示,长白山野杂猪的股二头肌与腰大肌肌纤维的直径和面积均低于商品猪,而肌纤维密度显著高于商品猪,但是长白山野杂猪的半腱肌和背最长肌的肌纤维直径、面积及密度同商品猪相比均没有显著差异。结果表明,长白山野杂猪的猪肉品质优于商品猪的猪肉品质。     

猪胎盘绒毛滋养层细胞体外原代培养

本研究旨在建立一种简便有效的猪胎盘绒毛滋养层细胞体外分离纯化方法。采用胰酶DNase I酶联合消化法消化母猪自然分娩后胎盘绒毛组织,以35%、45%2个Percoll密度梯度法进行猪胎盘绒毛滋养层细胞的分离纯化,并通过观察细胞形态、测定生长曲线、免疫荧光染色、透射电镜等鉴定猪胎盘绒毛滋养层细胞。结果表明,分离培养的猪胎盘绒毛滋养层细胞呈上皮样平铺成片生长,形态为多角形或类圆形,培养48h后部分细胞开始融合成多核合胞体滋养层细胞。免疫荧光染色结果显示,细胞角蛋白7染色阳性占91%以上,表明分离获得的猪胎盘绒毛滋养层细胞纯度较高。透射电镜观察显示,所获细胞具有典型滋养层细胞结构特征。综上表明,采用胰酶DNase I酶联合消化法和35%、45%2个Percoll密度梯度法进行分离纯化,可简便有效地获得较高纯度的猪胎盘绒毛滋养层细胞。     

癌症标记蛋白AGR2的原核表达及纯化

前梯度蛋白2(anterior gradient 2,AGR2)是一种分泌蛋白,在多种腺癌中过表达,是一个潜在的肿瘤诊断和预后判断的标志物。用质粒pGEX4T-1构建AGR2蛋白原核表达载体(pGEX4T-1-△SPAGR2),IPTG诱导表达,考马斯亮蓝染色和Western blot验证纯化的AGR2蛋白。结果表明,利用大肠埃希菌培养,原核表达载体(pGEX4T-1-△SP-AGR2)在25℃、0.1mmol/L IPTG诱导16h后AGR2蛋白大量表达,分离纯化得到具有生物活性的成熟AGR2蛋白,这对于开展AGR2生物机制的研究,以及开发AGR2的诊断和治疗试剂具有重要的意义。     

FABPs基因表达量与高黎贡山猪脂肪酸含量的相关分析

为探究FABP1、FABP3基因在高黎贡山猪肝脏、背脂和背最长肌3个组织中的相对表达量和脂肪酸含量的关系,本研究以高黎贡山猪为研究对象,采用气相色谱法测定其背最长肌脂肪酸含量,利用RT-qPCR技术检测FABP1、FABP3基因在高黎贡山猪背脂、背最长肌和肝脏中的相对表达量,并与脂肪酸含量进行相关分析。高黎贡山猪FABP1基因的表达趋势为：肝脏>背脂>背最长肌,FABP3基因的表达趋势为：背最长肌>肝脏>背脂;经与脂肪酸含量进行相关性分析,发现在肝脏组织中FABP1基因与十九酸的含量呈显著负相关;在背最长肌组织中FABP3基因与二十二碳一烯酸含量呈显著正相关,与二十碳五烯酸呈极显著正相关。结果表明,FABP3基因与高黎贡山猪多不饱和脂肪酸中的二十二碳一烯酸和二十碳五烯酸含量有相关性,但FABP1、FABP3能否作为影响高黎贡山猪脂肪酸含量的关键基因还需进一步探究。     

藏猪和大约克猪ACADM基因表达量与脂肪沉积性状的相关性分析

为探究中链酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)基因在不同品种猪组织中的表达水平,并分析其与猪脂肪沉积性状的相关性,采用Sanger测序法对藏猪(58头)和大约克猪(60头)ACADM基因起始密码子上游1 kb区域进行了单核苷酸多态性(SNPs)筛选与基因分型,选取180日龄藏猪和大约克猪各10头屠宰后分别采集肝脏、背脂、心脏和背最长肌组织,利用RT-qPCR技术检测了ACADM基因的表达水平,同时测定其背膘厚和背最长肌组织中肌内脂肪含量。结果显示:在ACADM基因起始密码子上游1 kb区域,存在C-101G和C-569G这2个突变位点,藏猪与大约克猪等位基因频率呈极显著差异(P<0.01);在藏猪与大约克猪的肝脏、背脂、背最长肌和心脏组织中ACADM基因表达趋势完全一致,藏猪极显著高于大约克猪(P<0.01);经ACADM基因表达量与背膘厚、肌内脂肪含量相关性分析发现,ACADM基因mRNA相对表达量与背膘厚和肌内脂肪含量呈显著正相关(P<0.05)。通过以上结果推测这2个突变位点可能是调控ACADM基因表达的重要功能位点,从而导致猪脂肪沉积性状的差异。本研究为进一步开展ACADM基因对猪脂肪沉积的调控机制研究提供了重要支撑。     

PCK1基因在延黄牛不同部位脂肪组织和内脏中的表达分析

试验旨在阐明延黄牛PCK1基因在不同脂肪组织与内脏器官的表达水平,探讨PCK1基因表达与脂肪沉积的关系。以延黄牛皮下脂肪和背最长肌及其他内脏器官为材料,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法,对PCK1mRNA和蛋白质水平在延黄牛脂肪组织和内脏器官中的分布规律进行分析。实时荧光定量PCR结果表明,PCK1基因在肾脏、皮下脂肪和腹部脂肪中的表达量均显著高于背最长肌和其他内脏器官(P0.05),在肾脏中的表达量显著高于皮下脂肪和腹部脂肪(P0.05),在腹部脂肪中的表达量显著高于皮下脂肪(P0.05);而在背最长肌、肺、心脏、小肠和肝脏中表达差异不显著。Western blot结果表明,在腹部脂肪中PCK1蛋白的表达量显著高于皮下脂肪(P0.05)。研究结果可为进一步探讨脂肪沉积机制及优化延黄牛肉品品质奠定基础。