凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

抑癌基因ING4转染对乳腺癌细胞MDA-MB-435S生物学行为的影响

目的 研究转染抑癌基因ING4对乳腺癌细胞系MDA-MB-435S生物学行为的影响.方法 携带ING4基因的真核表达质粒pcDNA3.0(+)-ING4利用脂质体瞬时转染乳腺癌MDA-MB-435S细胞,以转染pcDNA3.0(+)空载体和未转染的MDA-MB-435S作为阴性对照和空白对照.转染72 h后,RT-PCR检测转染前后ING4基因mRNA表达水平,MTT法检测转染各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞周期的变化,TUNEL实验检测各组细胞凋亡水平的变化.结果 转染ING4基因的MDA-MB-435S细胞ING4 mRNA表达水平明显上调;细胞增殖活力较空白组和阴性对照组下降(P＜0.05);细胞发生G2/M期阻滞(P＜0.05);细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01).结论 ING4基因通过G2/M期阻滞和诱导细胞凋亡的方式抑制乳腺癌细胞生长.     

Ubc9对肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响及机制探讨

目的探讨过表达Ubc9蛋白对人肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响及可能机制。方法构建pEGFP-N1-Ubc9真核表达载体,稳定转染到肺癌细胞系NCI-H446细胞,以蛋白免疫印迹实验检测外源Ubc9的表达,以流式细胞术分析细胞凋亡情况,利用Western blot方法检测转染前后NCI-H446细胞Bcl-2蛋白表达水平。结果成功构建Ubc9真核表达质粒,蛋白免疫印迹实验证实外源性Ubc9蛋白质于肺癌NCI-H446细胞高表达,流式细胞术检测发现目的蛋白质过表达后的细胞凋亡比率降低,转染组凋亡率(5.52±0.48)%明显低于空转染组的(10.11±0.92)%,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot方法检测转染组Bcl-2蛋白表达水平则高于空转染组。结论Ubc9高表达可以抑制NCI-H446细胞的凋亡,其凋亡水平的改变与影响Bcl-2蛋白的表达有关。     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

TGFB1抑制A549细胞增殖的分子机制研究

①目的 构建并鉴定TGFB1真核表达载体pcDNA3.1/TGFB1,探讨TGFB1抑制A549细胞增殖的可能机制.②方法 采用基因重组技术将TGFB1 CDS 插入真核表达载体pcDNA3.1 (+),构建TGFB1真核表达质粒.脂质体介导转染肺癌细胞A549,分为正常对照、空质粒及转染组.MTT和集落形成实验检测各组细胞活性和细胞增殖能力.Real-time- PCR及Western blot方法 检测各组中TGFB1、p53、Bax和Fas的mRNA和蛋白的表达水平.③结果 酶切和测序结果 证实TGFB1真核表达质粒构建成功.MTT和集落形成实验结果 显示pcDNA3.1/TGFB1转染组、细胞活性和细胞增殖能力明显降低(P<0.01).pcDNA3.1/TGFB1转染组与正常对照组、空质粒组比较:TGFB1、p53、Bax和Fas mRNA表达显著增加(P<0.01);TGFB1、p53、Bax和Fas蛋白的表达水平显著增加(P<0.01).④结论 TGFB1可能通过上调p53、Bax和Fas蛋白的表达抑制肺癌细胞A549的增殖.TGFB1有可能成为肿瘤生物治疗的靶点.     

野生型INK4a基因转染对肺腺癌A549细胞放疗敏感性的调控

目的研究野生型INK4a基因转染对人肺腺癌A549细胞放疗敏感性的调控.方法利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将含有人全长野生型INK4a cDNA的真核表达重组质粒pcDNA3.1-p16导入该基因位点缺失的人肺腺癌A549细胞系中,确定其编码蛋白p16稳定表达;在设立空白组和空质粒转染组的情况下,检测分析放射线对A549细胞的克隆形成率和杀伤效率的影响.结果转染INK4a基因后的细胞与未转染及空质粒转染的细胞相比:肿瘤细胞S期和G2/M期的比例下降,G0/G1期的比例增加,生长减慢,凋亡指数增加,放射线处理后克隆形成率减少,50%抑制剂量(ID50)略有降低.结论 INK4a基因转染增强了肺腺癌A549细胞对放射线的敏感性,为将来肺癌患者基因治疗提供了一定的实验依据.     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

弓形虫pcDNA3.1（+）-Flag-ROP18质粒构建及对RAW264.7细胞凋亡影响研究

目的构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体,体外研究弓形虫ROP18蛋白是否具有抑制H_2O_2诱导RAW264.7细胞凋亡的作用。方法通过PCR扩增ROP18基因,构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体,转染RAW264.7细胞,为重组质粒组;并设置未含POP18基因的空白质粒为对照组。分别检测重组质粒组与对照组线粒体及细胞质中细胞色素c含量。结果成功构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18重组质粒,通过双酶切鉴定,得到2个符合预期大小的条带。使用H_2O_2分别诱导重组质粒组与对照组对RAW264.7细胞的凋亡作用,分别检测线粒体及细胞质中细胞色素c含量,发现两组细胞色素c含量水平无区别。结论 ROP18没有抑制H_2O_2经线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡,为进一步探索ROP18蛋白功能及弓形虫病的发病机制提供了理论依据。