香蕉束顶病毒的提取及其特性的研究

香蕉束顶病(BBTD)严重危害着香蕉种植业,本研究对香蕉束顶病(BBTD)的发病原因及其病源物的理化特性进行了探讨,研究表明香蕉束项病(BBTD)是由香蕉束顶病毒(BBTV)引起的,其病源物是1kb的单链DNA(ssDNA).     

香蕉束顶病毒的分子生物学

香蕉束顶病毒为直径１８－２０ｎｍ的球形粒子,其,基因组至少含有六个约１．０ｋｂ的单链环状ＤＮＡ分子。     

应用Digoxigenin标记的cDNA探针检测香蕉束顶病毒

用非放射性的Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的１１－ｄＵＴＰ取代３２Ｐ标记的ｄＡＴＰ或ｄＣＴＰ，标记克隆的ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂｃＤＮＡ，制备成探针．通过核酸斑点杂交对粗提取的ＢＢＴＶ，ＢＢＴＶ－ＤＮＡ，感染ＢＢＴＶ的香蕉植物的拟茎，球茎处的组织，新生叶片以及成熟后的叶片进行了检测．结果表明：ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１ｃＤＮＡ探针特异性强，不与ＣＭＶ—ＲＮＡ、无毒香蕉组培苗提取的核酸发生杂交反应；仅与粗提ＢＢＴＶ、ＢＢＴＶ－ＤＮＡ、ＢＢＴＶ侵染的香蕉组织的核酸提取物发生杂交反应．此探针灵敏度高，可检出含有ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂ的质粒ＤＮＡ的最小量为１０ｐｇ；测定感病香蕉植株的拟茎汁液的最高稀释度可达１∶１２８，相当于０．４ｍｇ病蕉组织中的病毒含量．测定同一病株不同部位的结果表明，ＢＢＴＶ在植物体内的分布不均匀，拟茎处组织中病毒含量最高，球茎处的组织以及新生叶片中的病毒含量次之，成熟后的叶片中的病毒含量最低     

香蕉束顶病毒的分离与提纯

香蕉束顶病毒的分离与提纯＠曹先维＠孟清＠李宝庆＠张鹤龄＠孙茂林￥华南农业大学园艺系￥内蒙古大学生物学系￥云南省农科院植物保护研究所香蕉束顶病毒，分离，提纯香蕉束顶病毒的分离与提纯曹先维１，孟清２，李宝庆１，张鹤龄２，孙茂林３（１．华南农业大学园艺系，５１...     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4编码区功能研究

利用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物(BBTV-ZZ)DNA4编码区.序列分析结果表明该编码区由351个核苷酸组成,推测其编码是一个含116个氨基酸的蛋白质.利用植物双元载体pBin438构建了含有BBTV-ZZ DNA4编码区的植物组成型表达载体pBBTV-4B,经农杆菌介导转化了三生烟(Nicotiana tabacum Xanthi nc).在防虫条件下,将运动缺陷型CMV-Fny突变株(CMV-Fny-△MP)人工接种到转基因植株下部叶片上.12d后,在转基因植株的非接种叶上显现出不同程度的系统侵染症状.间接异种动物双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA)检测结果显示在转基因植株的上部非接种叶中有CMV-Fny的积累.而非转基因对照植株组的上部非接种叶中始终没有显现系统侵染症状,DAS-ELISA检测也未见CMV-Fny的积累.这些实验结果表明转基因植株能够支持CMV-Fny-△Mp从细胞到细胞和长距离运动并形成系统侵染症状.由此推测BBTV-ZZ DNA4编码的蛋白质可能具有运动蛋白功能.     

乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法的建立

目的建立乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法,应用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。方法滴定病毒TCID50,筛选JEV敏感细胞,依据国标IFA法制备抗原片,并进行特异性、敏感性和稳定性试验。结果选取BHK21细胞作为JEV敏感细胞,病毒感染力滴度(TCID50)为10-8.9.mL-1;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;稳定性和敏感性试验显示,不同时间IFA检测灵敏度均为1∶2560;可检测到的病毒滴度最低为10-6.5.mL-1。结论建立的IFA法敏感性、特异性强,稳定性好,可用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。     

大蒜病毒的快速检测

为建立一种快速便捷的检测大蒜病毒的方法,首先以4个大蒜产区的蒜种为材料采用传统的RT-PCR方法分析我国大蒜的主要病毒类型,在此基础上优化RT-PCR方法,建立大蒜病毒的快速检测方法.传统RT-PCR扩增到的序列经测序分析表明我国大蒜主要病毒类型为大蒜潜隐病毒GLV、马铃薯Y型病毒和大蒜新型病毒,通过优化RT-PCR方法、扩增模板、反应体系和循环次数,结果表明采用两步法RT-PCR方法,直接以RNA酶A处理的大蒜叶片Trizol裂解液为模板,经过40-45轮扩增循环,可以扩增到我国主要3种大蒜病毒,这为大蒜病毒的快速诊断提供技术支持.     

动态时域检测窗口的快速关键帧提取方法

在镜头检测基础上对帧图像进行逐帧处理、分析,从而获取关键帧的方法导致提取速度较慢,无法满足实时性要求。针对上述缺点,提出动态时域检测窗口的快速关键帧提取方法。该方法通过时域检测窗口把视频序列分割成长度不等的单元,并对窗口左右边缘帧以及窗口内的抽样帧进行分析、对比,从而判断视频单元的内容变化。同时,采用窗口混合增长模式和窗口慢检测机制保证关键帧提取的质量和速度。最终,对提取的关键帧序列进行聚类,得到最优的关键帧。实验证明,对于不同类型的视频,该方法都具有较高的综合评价性能。     

建立快速检测禽白血病病毒的液相芯片方法

目的建立快速检测禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)的液相芯片方法,为大量样品的检测提供技术支撑。方法制备抗ALV P27单克隆抗体,生物素标记抗体,磁珠偶联捕获抗体,利用Luminex200分析系统验证该方法的特异性、敏感性及重复性。结果阳性判定标准定为大于或等于空白对照的两倍。特异性检测结果显示与鸡的其他多种病原不存在交叉反应,特异性良好。同时多批次实验结果显示其变异系数在7%以内,说明该方法的稳定性好,可重复。结论建立的检测ALV病原的液相芯片方法特异性好,稳定且可重复。     

可视化LAMP技术快速检测新冠病毒的方法

根据时代需要,利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplifcation,LAMP)对新冠病毒进行快速检测,以研发出新冠病毒检测试剂盒.通过NCBI公布的新冠基因组序列分析,获得新冠病毒特异性N蛋白基因的序列;根据该序列信息,在线设计的几对环介导等温扩增引物以供筛选,并利用新冠病毒全基因的反转录质粒,同时通过大量的实验尝试,得到较为稳定的环介导等温扩增体系,再加入具有逆转录活性的Bst 3.0 DNA聚合酶,使体系可扩增RNA模板,最后通过加入适量染料,完成反应结果的可视化.通过不断的实验优化,得到了较为稳定的扩增体系如下:2×Lamp Master Mix 12.5μL,Bst 3.0 DNA聚合酶0.5μL,内引物FIP、BIP(10μM)各2μL、外引物F3、B3(10μM)各0.5μL、模板1μL、ddH2 O 7μL,该体系在65℃下水浴加热1 h即可,同时在体系中加入MnCl2溶液(15 mM)1μL、钙黄绿素(500μM)3μL,使反应结果肉眼可断,加入模板的体系变为绿色,而未加模板的体系为棕黄色.结论:本实验研究的可视化LAMP检测新冠病毒的方法可用于对广大人民群众进行新冠病毒核酸检测.     

用于转基因植株检测的DNA快速微量提取方法

摘要建立了一个用于转基因小苗检测的DNA快速微量方法.每20mg新鲜叶片可提出约10μgDNA，且DNA有较好的完整性，A260/280值在1.7～1.9范围内，并适合于点杂交和PCR分析.     

常规RT-PCR快速检测诺如病毒方法的建立

目的建立一种可同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒(Norovirus,NOV)的常规RT-PCR方法.方法针对GⅠ、GⅡ型诺如病毒RdRp区域的基因进行引物设计,优化PCR反应体系及条件,评价该方法的灵敏度、特异度.结果该引物对诺如病毒的特异度强,同一体系内的GⅠ、GⅡ型诺如病毒相互之间无干扰,与轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒同时检测无交叉反应;对GⅠ、GⅡ型诺如病毒核酸的最低检测限值是10~3拷贝/μL.结论本研究建立常规RT-PCR检测方法对GⅠ、GⅡ型诺如病毒进行快速检测,具有很好的灵敏度和特异性.     

邻苯二甲酸二丁酯(塑化剂)荧光量子点快速检测方法研究

通过荧光量子点标记技术,竞争法免疫层析快速检测技术建立了邻苯二甲酸二丁酯的快速检测方法,并开发出用于检测邻苯二甲酸二丁酯的荧光量子点快速检测试纸,其检测白酒最低检出限为0.85 ng/mL.所建立的方法操作简单,快速,灵敏度高,特异性好,是白酒中DBP残留物的快速检测的有效手段.     

一种快速提取致癌农杆菌(Agrobecterium tumefaciens)Ti质粒的方法

本文比较了前人提取致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的方法,改变了溶菌的条件和蛋白质除去的程序,找到一种简易、快速、重复性高的提取Ti质粒的方法。本文的方法是将一份致癌农杆菌细胞同四份碱性SDS溶菌液(pH12.6)混合,这样溶菌液的pH为10.5,然后将此碱性溶菌液(pH10.5)置37℃保温30分钟。为了有效地提取Ti质粒又改变了去除蛋白质的程序,溶菌液首先用苯酚—氯仿抽提,随之加5M NaCl于溶菌液中,使NaCl最终浓度达0.6M,溶菌液于冰水中盐析2小时,悬浮的溶菌液经高速高心,大部分蛋白质和变性DNA被除去,DNA提取液由混浊变清。这种方法也可以用于提取其它菌株中的小分子质粒。     

套式PCR检测淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)方法应用

目的检测目前小鼠和地鼠中淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的感染情况。方法采用套式PCR方法对小鼠和地鼠脑及小鼠脏器进行扩增,检测LCMV基因;同时对血清进行ELISA试验,将两种方法的结果进行比较。结果从小鼠的脾脏和肾脏中检测到NP基因的存在,检出率2/148;ELISA检出率5/148。结论PCR与ELISA检测方法相结合,准确率高,证明目前小鼠中存在LCMV的感染。     

禽流感病毒H7亚型快速检测方法建立及应用

通过杂交瘤技术及单克隆抗体技术获得针对禽流感病毒H7亚型的特异性单克隆抗体.抗体用于标记荧光微球,并基于双抗体夹心免疫层析法用于对禽流感病毒H7亚型的检测.针对禽流感病毒H7亚型,检出限为0.125 HAU,具有较高的灵敏度,所建立的禽流感病毒H7亚型荧光检测试纸具有良好的特异性和准确性,可用于对禽流感病毒H7亚型的现场快速检测.     

基于均值漂移的海岛(礁)岸线快速提取

为了解决海岛(礁)岸线提取的自动化问题,提高海岛(礁)岸线提取的速度与精度,提出了基于均值漂移的海岛(礁)岸线快速提取方法。首先在保证影像整体轮廓的同时构建低分辨率影像,从而缩短算法的运行时间;然后利用均值漂移技术进行高斯低通滤波处理,提高算法的抗噪性;最后通过区域增长法自动选择种子点,结合区域合并差异性度量准则实现对遥感影像的形状和颜色的识别,从而完成对海岸线的自动提取。使用该方法对海岛(礁)影像进行了海岛(礁)岸线提取实验,实验结果表明,该算法能够实现所有岛礁岸线的自动提取,相比于通过人工方式,提取时间从729s缩短为3s,极大地缩短岸线提取的时间,同时能较好地满足成图效果。     

坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶绿体DNA 的快速提取

以阴干的坛紫菜叶状体为材料，通过酶解等方法获取完整的叶绿体．再裂解叶绿体并酚仿抽提获得叶绿体DNA．限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切及RAPD检测结果显示：叶绿体DNA与基因组DNA的酶切图谱及RAPD图谱均有比较明显的差异．多次重复实验证明，按此法提取的叶绿体DNA．其得率稳定，并可用作PCR扩增的模板及酶切图谱的构建等．该方法操作简便．过程快捷．可作为大型海藻叶绿体DNA提取的参考方法．     

一种快速检测植物病毒RNA蓄积量的竞争PCR方法

用Oligo6.6软件在pUC18上设计1对比目的基因多100～200 bp的内参引物,摸索了目的基因和内参共同扩增的竞争PCR反应条件,测定了嘧肽霉素处理对烟草组织中烟草花叶病毒RNA相对含量的影响,同时用间接ELISA方法验证了该方法.试验结果表明:竞争PCR的方法能够快速、相对准确的测定植物组织中病毒RNA蓄积量的变化情况.     

植物病毒RNA提取方法的研究

病毒RNA提取技术是分子生物学中经常应用的重要技术,是对RNA病毒在分子水平进行研究的必要手段.介绍了一种从染病植物组织中提取病毒RNA的方法,利用此方法提取了马铃薯x病毒(PVX)的RNA基因组,并通过RT-PCR得到其外壳蛋白基因,提取的病毒RNA在纯度和产量上都可满足反转录和PCR扩增等基本分子生物学操作.