鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastoris X-33.重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应.结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达.     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL-18克隆质粒扩增获得了ChIL-18全基因片段，并将其重组到真核表达载体pcDNA3．1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序，鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3．1( )真核表达质粒上；将重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ChIL-18转染COS-7细胞，转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA。SDS-PAGE分析表明，表达产物是与ChIL-18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明，表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

鸡白介素18基因原核表达质粒构建

根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1 8的生物学特性及其临床应用打下了基础     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

鸡源志贺菌IpaC基因变构体重组酵母表达载体的构建及初步表达

为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性,实现在酵母表达系统中高效表达,本研究首先采用反向PCR将IpaC基因358~360位和361~363位酵母菌低频密码子突变为偏嗜性密码子,并进一步构建了克隆载体pMD18-T-IpaC*和酵母表达载体pPICZαA-IpaC*,然后将线性化重组质粒pPICZαA-IpaC*电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子进行诱导表达,并用SDS-PAGE检测其表达产物。结果表明SDS-PAGE在大约63 000处检测出目的条带,实现了鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的初步表达。这为进一步研究IpaC生物学功能奠定了基础。     

猪IL-18在酵母中表达及活性检测

以pGEMT/pIL-18为模板,应用PCR法扩增出猪IL-18基因,用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后,插入酵母表达载体pPICZαA中,经酶切、PCR扩增及序列测定,成功构建了酵母重组表达载体pPICZ/pIL-18,电击转化毕赤酵母X-33,应用Zeocin筛选获得高拷贝重组转化菌株,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析重组pIL-18蛋白的表达,并用SephadexG200纯化表达的重组pIL-18蛋白.运用MTT法检测其生物学活性.试验结果表明,重组X-33酵母菌株能够表达分泌性pIL-18,诱导72 h表达量最高,其表达量占总蛋白表达量的38％.而且纯化的重组pIL-18蛋白具有明显促进淋巴细胞增殖的活性.     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

鸡IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT—PCR方法，从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MIDCC-MSBI总RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明，克隆得到的ChIL-18cDNA与国外报道的完全一致，包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp，编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL-18成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，构建成原核表达质粒pGEX—ChIL18。该质粒的BL21(DE3)DysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST—ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32％。     

抗菌肽SMAP-29基因密码子优化及其毕赤酵母表达载体构建

以GenBank发表的绵羊骨髓抗菌肽(SMAP-29)基因(L46854)为模板,选择毕赤酵母偏好密码子,合成SMAP-29成熟肽基因。将合成的基因克隆入pPIC 3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC 3.5K-SMAP-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。表达载体的正确构建为SMAP-29的高效表达和生物学活性研究奠定基础。     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达

根据GenBank中鸡myostatin（AF019621）成熟区段的cDNA序列设计了1对引物，利用PCR技术扩增了萧山鸡myostatin的成熟区段，构建了重组真核表达载体myostatin-pPIC9K，并在甲醇酵母中融合表达了myostatin蛋白。结果发现，萧山鸡myostatin基因存在2处碱基变异：T^204→C^204（编码的氨基酸没有变），C^205→T^205（编码的氨基酸由Pro变成Ser），从而产生了1个EspⅠ或Bpull02Ⅰ限制性内切酶酶切位点。核苷酸序列同源性分析表明，myostatin基因成熟区段DNA在不同物种间具有高度的保守性。SDS-PAGE鉴定结果表明，表达的目的蛋白（26ku）具有生物学活性。     

抗脂肪细胞40 000特异膜蛋白scFv-Fc融合抗体毕赤酵母表达载体的构建

采用RT—PCR方法从人外周血淋巴细胞克隆IgG1 Fc片段基因，经序列分析表明，该Fc片段基因长699bp，具有完整的铰链区、CH2和CH3结构区，与GenBank中人IgG1重链Fc片段基因序列完全相同。将Fc片段基因与pPICZaA酵母载体连接先构建pPIgG1质粒，然后将抗脂肪细胞40000特异膜蛋白的噬菌体scFv抗体基因插入到pPIgG1质粒，构建pPIgG1-scFv酵母表达载体。序列分析表明，scFv基因与Fc片段基因拼接正确，阅读框正确无误，表明成功构建了抗脂肪细胞40000特异膜蛋白scFv—Fc融合抗体毕赤酵母表达载体。本试验为下一步在毕赤酵母中大量表达与IgG结构相似、具有较高亲和力和生物活性的scFv—Fc融合抗体分子奠定了基础。     

牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定

为高效分泌表达牛α干扰素(boIFN-α),本研究通过人工合成boIFN-α基因,将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-boIFN-α,将其电转化于毕赤酵母菌株GS115,利用抗药选择压力G418筛选重组菌,对重组菌诱导表达,取上清进行SDS-PAGE和western blot检测,并优化重组菌的诱导表达条件.结果显示:筛选获得高效分泌表达boIFN-α的重组菌,其最佳诱导条件为:250 r/min,26℃培养,1％甲醇浓度诱导,诱导72 h.上清中目的蛋白表达量最高可达200 μg/mL,本研究为boIFN-α在生产中的应用奠定了基础.     

犬细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和在毕赤酵母中表达

表达犬细小病毒VP2蛋白（CPV—VP2）,用于重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并为犬细小病毒病的诊断奠定基础。采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中,构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33中,甲醇诱导表达CPVVP2,SDs_PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白。结果,成功扩增了CPV—VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZAA—VP2,在毕赤酵母菌中表达出约68000蛋白。Western—blotting鉴定表明,表达蛋白为目的蛋白VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养,上清液用70％过硫酸铵4℃沉淀浓缩,采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组的酵母表达的带组氨酸标签的VP2蛋白,表达量约3mg／L。结果表明,在毕赤酵母中成功地表达了CPV—VP2蛋白,且能被犬细小病毒VP2单克隆抗体特异识别。     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的裁体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确.     

猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。     

羊白细胞介素-18成熟蛋白的酵母表达和生物学活性研究

为了研究重组羊白细胞介素(gIL)-18在酵母系统中的高效表达,进一步阐明该重组蛋白的生物学活性,以含有gIL-18基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,构建重组表达质粒pPICZ-gIL-18,转化于毕赤酵母GSll5,以甲醇诱导表达,经sDS-PAGE和western blot分析证实了重组蛋白的表达,分泌的重组gIL-18表达量为100 mg/L.经纯化后用MTT法和MDBK-VSV法检测表达的重组IL-18体外生物活性,利用免疫试验检测了重组蛋白对羊痘疫苗的免疫增强作用.实验结果表明,该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性,比活性为1.5×105 u/mg.体外具有增强羊痘疫苗的活性.毕赤酵母分泌表达的重组gIL-18具有良好的生物学活性,为gIL-18作为免疫佐剂和免疫治疗剂的大规模应用奠定了基础.     

Expression,Purification and Biological Activity Identification of Chicken Growth Hormone in Pichia pastoris

The growth hormone（GH）regulated diverse functions of the target cells through binding its receptor and played important roles in the process of metabolism of the body's growth and development.In order to obtain high purity chicken growth hormone（cGH）with biological activity,the gene segment of the mature cGH with six histidine at the C terminus was cloned into the expression vector pPIC9K.The recombinant plasmid（pPIC9K-cGH）was transformed to Pichia pastoris（GS115）by electroporation to construct the recombinant Pichia pastoris（GS115-pPIC9K-cGH).The GS115-pPIC9K-cGH secreted the recombinant protein（cGH）whose molecular weight was about 25 ku induced by 1% methanol induction for 96 h.The purity of cGH attained at least 95% through using Ni affinity chromatography and polyacrylamide glucan gel chromatography to purify the recombinant protein.The results of Real-time quantitative-PCR showed that the purified cGH recombinant proteins could up-regulate its target gene insulin-like growth factor Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA in chicken liver cancer cell（LMH).It certified that the recombinant cGH protein had biological activity.This study laid a foundation for research of the structure,function and application of cGH.