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以酿酒酵母基因组DNA为模板,根据CenBank上公布的酿酒酵母Ravlp基因(rav1)序列和表达裁体特性设计 特异性引物,PCR扩增得到4 074 bp的DNA片段,将PCR产物和原核表达栽体pET28a(+)同时进行双酶切;双酶切后的PCR产物和表达栽体进行连接,构建成重组质粒pET28a-ravl.再将pET28a-ravl转化到BL21( DE3)感受态细胞中.经IPTG 16℃低温诱导40h表达His-tag融合的Ravlp.诱导后的菌体进行超声波破碎,然后用GE healthcare公司的AKTA蛋白纯化仪和His Trap HP I mL亲和层析柱纯化目的蛋白.SDS-PAGE电泳分析和Western blot分析显示在155 kD有明显的条带,成功实现了Ravlp在大肠杆菌中的表达纯化. 相似文献
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从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3~5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体。经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为47kD,凝胶自动扫描分析表明,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的15%以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。 相似文献
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人角质细胞生长因子2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建人角质细胞生长因子2(hKGF2)基因的高效原核表达载体pET-30a( )-hKGF2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。方法:从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出去除了信号肽部分的hKGF2基因,克隆到pMD18-T载体,经DNA序列分析后与pET-30a( )表达载体连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达6×His-hKGF2,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白。结果:构建了表达载体pET-30a( )-hKGF2,经IPTG诱导后,表达的重组蛋白理论相对分子质量约为23000,约占菌体总蛋白的20%。结论:6×His-hKGF2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性高效表达,为获得高纯度、高活性的产物,以及进一步的大规模生产和应用研究奠定了基础。 相似文献
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人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
利用反转录PCR(RTPCR)法从人肝组织中分离人白介素18(hIL18)基因。克隆到Tvectoreasy载体中,经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以pBV220为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了hIL18基因,重组蛋白占菌体总蛋白的27.2%。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。 相似文献
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费氏中华根瘤菌与耐盐有关基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)RT19与耐盐有关的4.4kb DNA片段含有3个相间的开放阅读框,经亚克隆及功能检测,证实其中的ORF2与耐盐有关,将ORF2分别克隆到表达载体pTHioHisA、B和C上,得到3个重组质粒pGA、pGB和pGC,转化大肠杆菌(escherichia coli)5α。经IPTG诱导后和作SDS-PAGE分析,发现只有pGC编码的融合蛋白获得了表达,其分子量为53kDa。恰好是trxA基因编码的硫氧还蛋白与推测的蛋白质分子量之和。Westerm印迹证实,表达的蛋白质是trxA基因和目的基因编码的。 相似文献
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大肠杆菌trpBA基因的克隆表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b( )中,得到重组质粒pet22b( )-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b( )-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。 相似文献
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酒类酒球菌mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
苹果酸通透酶具有协助苹果酸 乳酸发酵 (MLF)的重要功能。以酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)优良菌系Oenococcus Lee SD 2a的总DNA为模板 ,用PCR方法克隆到苹果酸通透酶基因mleP ,构建了重组质粒pBMmleP。序列分析表明克隆到的基因序列与已报道的序列同源性为 99%。为使目的基因在酿酒酵母中表达 ,以大肠杆菌 酿酒酵母穿梭质粒YEp35 2为载体 ,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件 ,构建了重组表达质粒YEpmleP ,并转化酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)YS5 8。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。获得的转化子在添加了L 苹果酸 (5g L)的培养基中培养 4d ;取培养液上清用HPLC检测 ,结果显示重组转化子YSP的培养液中L 苹果酸剩余含量均低于空载体转化子YS35 2 ,因此所得酵母重组转化子对苹果酸的转运能力有所提高 相似文献
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苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d;取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量,采用t检验进行差异显著性分析,结果表明mleA基因进行了功能性的表达,将L苹果酸转化成L乳酸,L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著,苹果酸的相对降低率平均为20.95%。在有选择压力条件下,重组质粒相对稳定,而在无选择压力条件下,传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。 相似文献
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转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。 相似文献
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首次从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆得到L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,ldhL)基因,并将其连接到pSE380表达载体上,得到重组质粒pSE380ldhL,将重组质粒转化到乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJl44大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达产物的分子量约为34kD,摇瓶发酵后用HPLC检测分析L-乳酸产量为2.4g/L,纯度达到99.9%,不需要再进行手性分离,为以后在工业上生物法生产高纯度的L-乳酸打下基础。 相似文献
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An alpha-amylase gene (AMY) was cloned from Schwanniomyces occidentalis CCRC 21164 into Saccharomyces cerevisiae AH22 by inserting Sau3AI-generated DNA fragments into the BamHI site of YEp16. The 5-kilobase insert was shown to direct the synthesis of alpha-amylase. After subclones containing various lengths of restricted fragments were screened, a 3.4-kilobase fragment of the donor strain DNA was found to be sufficient for alpha-amylase synthesis. The concentration of alpha-amylase in culture broth produced by the S. cerevisiae transformants was about 1.5 times higher than that of the gene donor strain. The secreted alpha-amylase was shown to be indistinguishable from that of Schwanniomyces occidentalis on the basis of molecular weight and enzyme properties. 相似文献
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Expression of the Escherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae 总被引:2,自引:0,他引:2
A V Sarthy B L McConaughy Z Lobo J A Sundstrom C E Furlong B D Hall 《Applied and environmental microbiology》1987,53(9):1996-2000
Transformation of Saccharomyces cerevisiae by yeast expression plasmids bearing the Escherichia coli xylose isomerase gene leads to production of the protein. Western blotting (immunoblotting) experiments show that immunoreactive protein chains which comigrate with the E. coli enzyme are made in the transformant strains and that the amount produced parallels the copy number of the plasmid. When comparable amounts of immunologically cross-reactive xylose isomerase protein made in E. coli or S. cerevisiae were assayed for enzymatic activity, however, the yeast protein was at least 10(3)-fold less active. 相似文献
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酿酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大肠村菌中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
用PCR方法克隆了1.5kb的酿酒母Sacchromyces cerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI,将该片段连接到pUC19载体,通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌Escherichia coli FF4169 和FF4050,对转化株的质粒DNA酶切分析表明均含有1.5kb PCR克隆片段,生长曲线实验证明,带有克隆片段的转化株在含0.5mol/L NaCl的高渗透压基础培养基中生长良好;用高效液相色谱(HPLC)结合蒸发散射(ELSD)技术测定细胞内海藻糖实验证明转化株能够合成海藻糖。 相似文献
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解毒酶基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达 总被引:9,自引:0,他引:9
用RT-PCR克隆了酯酶B1 5′端B1(a),并对其者了序列测定,将其与3′端B1(b)一起连接到pET-28a中,构了完整融合表达载体pET-ESTB1。转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下,经过12小时,酯酶B1在大肠杆菌内的融合表达达到27%。通过纯化获得1条带的重组蛋白,用粗酶对马拉硫磷的降解显示,该解毒酶在15分钟即降解22.1%,具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力,为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等提供了新途径。 相似文献
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利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)克隆3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3-磷酸甘油酯酶基因(hor2),并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE-gpd1-hor2,将重组质粒导入大肠杆菌BL21菌株中,构建得到的重组菌株GxB-gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB-gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为46.67g/L,葡萄糖的转化率为42.87%。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3-丙二醇的工程菌打下了良好的基础。 相似文献