去势大鼠骨髓基质干细胞分离培养鉴定及增殖特性的变化

目的:对去势大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)进行分离培养鉴定,研究去势后大鼠BMSCs增殖特性的变化.方法:以去势大鼠作为绝经后骨质疏松症模型,分为去势组和假手术组.密度梯度离心分离骨质疏松大鼠的BMSCs,利用BMSCs的多向分化培养及流式细胞仪分析对去势大鼠BMSCs进行鉴定,倒置相差显微镜观察细胞增殖情况,MTT法测量两组BMSCs增殖能力.结果:去势组大鼠体质量、雌二醇及整体股骨骨矿物质密度(BMD)与假手术组比较差异有显著性(P＜0.01),诱导培养后两组大鼠BMSCs油红O染色和Von Kossa's染色实验阳性,流式细胞仪显示骨髓间充质细胞具有的表面抗原CD29和CD44阳性而造血干细胞具有的表面抗原CD45和CDl33为阴性.MTT法测定在7 d内,去势组细胞的增殖速率要高于假手术组.结论:成功建立了大鼠骨质疏松模型.采用成骨诱导和成脂诱导也进一步证实了所分离的细胞为具有多向分化潜能的BMSCs.去势后3mo大鼠BMSCs增殖能力增强.     

BMSCs移植对单侧输尿管结扎大鼠CD4~+CD25~+Treg的影响

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对单侧输尿管结扎(UUO)梗阻性肾病模型大鼠外周血调节性T细胞CD4+CD25+Treg以及肾脏组织CD4+CD25+Treg特异性标志物FoxP3表达影响。方法自Wistar大鼠分离BMSCs,经体外传代培养、成脂诱导及鉴定后制备细胞悬液。54只Wistar大鼠随机分为假手术组、BMSCs干预组和生理盐水注射组,每组18只。BMSCs干预组和生理盐水注射组大鼠经UUO建立梗阻性肾病模型,并于造模同时经下腔静脉分别注入BMSCs和等体积生理盐水。分别于造模后第3、7和14天,采集外周血后分批处死各组大鼠(每组6只),留取肾脏组织标本。流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Treg占CD4+Treg的百分比(CD4+CD25+Treg/CD4+Treg);HE染色光学显微镜观察肾脏组织病理学改变;免疫荧光组织化学方法检测肾脏组织CD4+CD25+Treg特异性标志物FoxP3表达。结果 BMSCs干预组和生理盐水注射组大鼠造模后各时点外周血CD4+CD25+Treg/CD4+Treg均明显高于假手术组(P<0.05),BMSCs干预组与生理盐水注射组比较差异无统计学意义...     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的标记跟踪及自体移植对骨折愈合的影响

目的：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,分别采用BrdU、DAPI对BMSCs进行体外染色标记,同时自体移植BrdU标记的BMSCs,观察其对大鼠胫骨骨折愈合的影响。方法：BMSCs取自SD大鼠的股骨和胫骨,分离培养BMSCs至第三代时,采用流式细胞仪对其表面抗原CD34、CD44和CD45进行测定;同时分别用BrdU、DAPI对BMSCs进行染色标记。选取3月龄雌性SD大鼠24只,随机分为三组（n=8）,A组为左胫骨骨折组,B组为左胫骨骨折+DMEM组,C组为左胫骨骨折+骨髓间充质干细胞移植组。术前两周C组取自体BMSCs,采用BrdU标记,术后2天将标记好的细胞以局部注射的方法移植到骨折断端,同时B组局部注射等量DMEM。各组动物分别于术后1、2、3、4周拍摄左胫骨DR,测量骨痂宽度,评价骨折愈合情况。结果：流式细胞仪检测证实：实验成功分离培养出了高纯度的BMSCs（免疫表型CD44阳性,CD34、CD45阴性）;采用BrdU（浓度10μmol/L,时间48hours）和DAPI（浓度20μg/ml,时间30 min）染色标记BMSCs安全有效;BrdU标记的BMSC...     

自体骨髓间充质干细胞经皮注射修复骨缺损的实验研究

目的 比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)、成骨诱导后的BMSCs以及二者联合经皮移植后体内成骨能力的差异,为骨组织工程选择种子细胞提供依据.方法 取第2代BMSCs进行成骨诱导.分别将BMSCs、成骨诱导的BMSCs、BMSCs联合成骨诱导后的BMSCs、生理盐水经皮注入兔桡骨中段骨缺损处.通过组织学、放射学、生物力学方法在不同时相比较骨缺损区修复情况.结果 BMSCs与成骨诱导后的BMSCs联合移植组在12周内骨缺损区新生骨的数量和质量显著优于BMSCs移植组和成骨诱导的BMSCs移植组(F=226.6,P＜0.01),空白组骨缺损主要由纤维结缔组织填充.结论 BMSCs与成骨诱导后的BMSCs联合移植存在协同效应,具有更强的成骨能力,可作为种子细胞应用于骨组织工程.     

PPARδ激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞分化的作用

目的：探讨过氧化物酶体增殖激活受体δ( PPAR δ)激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞( BMSCs)向成脂和成骨方向分化的作用。方法全骨髓培养法培养大鼠原代BMSCs后采用差速贴壁法纯化,流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物,实验分为PPAR δ激动剂组和对照组,分别进行成骨和成脂方向诱导培养,荧光定量PCR检测成骨细胞分化标志物(碱性磷酸酶、骨钙素)和脂肪细胞分化标志物(脂肪酸结合蛋白2、脂连素) mRNA的表达,油红O 染色检测脂肪细胞分化,茜素红染色检测成骨细胞矿化情况。结果与对照组比较,PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨细胞方向分化标志物表达,抑制向脂肪细胞方向分化标志物表达。茜素红染色显示PPAR δ激动剂组细胞矿化结节较对照组增加,油红染色显示PPAR δ激动剂组脂肪小滴明显减少。结论 PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨方向分化,抑制其向成脂方向分化。     

改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的 建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，为组织工程支架研究提供细胞基础。方法 分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法，对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中，将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性，流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化，并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能，通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果 改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一，细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论 改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜...     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞移植对正己烷中毒大鼠脊髓神经组织的修复作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对正己烷中毒大鼠脊髓神经组织的修复作用。方法 将健康成年雄性SD大鼠随机分成5组,每组20只。分别为：对照组（control）、干细胞对照组（BMSCs）、染毒组（HD）、自身修复组（HD+NS）和干细胞干预染毒组（HD+BMSCs）。对照组腹腔注射生理盐水,10周后处死动物。BMSCs组腹腔注射生理盐水5周后,行尾静脉干细胞移植术,5周后处死动物。HD组按400 mg/kg剂量,对大鼠腹腔注射2,5-己二酮（2,5-hexanedione,HD）,每周1次,持续注射5周后,处死动物。HD+NS组对大鼠腹腔注射HD 5周后,经尾静脉注射生理盐水1 mL, 5周后处死动物。HD+BMSCs组对大鼠腹腔注射HD 5周后,经尾静脉行干细胞移植,5周后处死动物。实验5周后观察大鼠的一般状态并进行步态评分。透射电镜观察处死后大鼠脊髓神经组织超微结构。MAP-2和SMI312双标记免疫荧光染色和LFB染色观察大鼠脊髓神经组织轴突和髓鞘变化。结果HD+NS组大鼠一般状态差、精神萎靡、无法站立、呈瘫痪状,步态评分为（4±0.38）分,属严重异常。HD+BMS...     

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的 观察糖尿病大鼠模型骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖、抗凋亡和成骨分化能力。方法 将40只6周龄雌性SD大鼠随机分为2组,每组20只,实验组腹腔注射链脲佐菌素,对照组注射等量的生理盐水。处理10周后,采用贴壁法获得2组大鼠的BMSCs。应用CCK-8检测第2代BMSCs增殖能力,0.3%过氧化氢和血清剥夺诱导的BMSCs凋亡;成骨诱导培养4周后, RT-PCR检测I型胶原蛋白(COL-I)、骨钙素(OCN)和核心结合蛋白因子-2(Runx-2)的mRNA表达水平;应用酶联免疫吸附法定量分析细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及von Kossa染色分析矿化能力。结果 链脲佐菌素成功诱导制备糖尿病大鼠模型。与对照组比较,实验组BMSCs增殖和抗凋亡能力降低,细胞成骨相关基因表达下降,细胞碱性磷酸酶活性显著降低,细胞成骨分化能力减弱(P<0.01)。结论 糖尿病大鼠来源的BMSCs体外增殖、抗凋亡作用减弱,成骨分化能力显著下降。     

唑来膦酸对去势大鼠骨折后骨痂和骨微结构的影响简

目的 探讨唑来膦酸对去势大鼠骨折后骨痂和骨微结构的影响.方法 将45只SD雌性大鼠分为骨质疏松组（30只）和正常对照组（15只）,骨质疏松组雌性大鼠被切除双侧卵巢制作骨质疏松动物模型,正常对照组大鼠仅给予假手术;骨质疏松模型建模成功后,将骨质疏松组30只大鼠再次随机分为生理盐水组（15只）和唑来膦酸组（15只）;对两组大鼠制作股骨骨折模型,并分别给予生理盐水和唑来膦酸进行干预;在药物干预4周后,比较生理盐水组和唑来膦酸组骨质疏松大鼠股骨骨痂和骨微结构情况.结果 卵巢切除术后8周,正常对照组和骨质疏松组大鼠股骨的骨密度分别为（0.197±0.028）g/cm2和（0.128±0.037）g/cm2,差异有统计学意义（P＜0.05）;在药物干预4周后,两组骨质疏松大鼠股骨均有骨痂形成,而唑来膦酸组大鼠骨痂明显大于生理盐水组,且骨折线较为模糊;与生理盐水组大鼠比较,唑来膦酸组大鼠骨小梁间隙较小,排列也较为整齐致密,更接近正常对照组大鼠.结论 唑来膦酸可促进骨质疏松大鼠骨折后骨痂形成,并提高其骨密度.     

富血小板血浆联合右归饮对骨质疏松模型大鼠的实验研究

目的研究富血小板血浆(PRP)联合右归饮对大鼠骨质疏松性骨折的影响。方法 8月龄SPF级SD雌性大鼠148只,随机分为4组:空白模型组(K组)、右归饮组(Y组)、PRP组(P组)、联合组(L组)。K组不做处理,其中P组和L组于骨折造模术前眼眶采血,制备PRP,在骨折模型建立术中将PRP凝胶注入骨折端;Y组及L组给予右归饮灌胃。观察骨折端影像学以及病理组织学变化,比较四组骨折愈合情况。结果从Micro-CT的骨痂图可见Y组、P组及L组在骨折后同一时间点骨痂的骨量较K组高。定量分析得出,每个时间点都是L组BV及BV/TV最高。组织病理学观察可见各实验组较K组的骨痂生长有明显改善。免疫组织化学观察结果:Col2a1在L组和P组在骨折术后1周表现为中度阳性,术后2周为强阳性,术后4周与6周为弱阳性。Y组骨折术后1周、2周均表现为中度阳性,术后4周与6周为弱阳性,K组术后1周表现为中度阳性,2周和4周时表现为弱阳性,6周时表现为阴性。结论 L组治疗大鼠骨质疏松性骨折较单纯的P组和Y组治疗效果更佳,能显著提高大鼠骨质疏松性骨折愈合质量,明显缩短骨折愈合周期。     

同种异体骨髓基质干细胞治疗骨缺损的实验研究

目的通过移植大鼠同种异体骨髓基质干细胞,配合免疫抑制剂治疗大鼠颅骨缺损,与对照组进行比较,探索一种治疗骨缺损的新方法。方法选取SD大鼠40只,随机分为四组：同种异体骨髓基质干细胞移植组,同时给以免疫抑制剂治疗;自体骨髓基质干细胞移植组;单纯同种异体骨髓基质干细胞移植组,单纯支架组。四组分别在脑颅骨上造成骨缺损模型后取供体组和自体组骨髓,移植到同步预制骨缺损大鼠模型缺损处,分别于术后8、10、12、13周对骨缺损处进行大体观察,X线摄片,病理取材。结果同种异体骨髓基质干细胞移植组,术后8周观察,骨样组织铺满支架,骨缺损治愈率85%;自体骨髓基质干细胞移植组,术后10周观察,骨样组织铺满支架,骨缺损治愈率82%;未用免疫抑制剂同种异体骨髓基质干细胞移植组,术后12周,只有少量骨样组织形成,骨缺损治愈率0%;单纯支架组骨样组织生长缓慢,术后13周仍未铺满支架。骨缺损治愈率10%。骨缺损治愈率85%。结论应用免疫抑制剂防止移植排斥反应的同种异体骨髓基质干细胞移植效果与自体骨髓基质干细胞移植效果差别很小,具有实用价值。     

产前使用地塞米松对坏死性小肠结肠炎新生鼠Toll样受体4表达的影响

目的观察产前使用地塞米松(dexamethasone,DEX)对新生大鼠坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocoli-tis,NEC)发生率及肠道Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)表达的影响,探讨其对NEC的保护作用及可能的机制。方法实验分为正常对照组、产前地塞米松干预组(DEX组)、产前生理盐水干预组(normal saline,NS组)3组,于孕16、17、18 d时DEX组孕鼠肌肉注射DEX 0.5 mg/(kg.d),NS组每天注射NS 0.3 ml。DEX组及NS组所生新生鼠建立NEC动物模型。正常对照组不予处理。于第5天处死新生鼠,观察近回盲部肠组织病理变化并做评分;免疫组化法检测TLR4蛋白的表达;其余小肠部分Q-PCR法检测TLR4 mRNA的表达。结果与NS组相比,DEX组新生鼠NEC发生率明显降低(P<0.01)。正常对照组未出现NEC症状,NS组新生鼠出现典型的NEC症状,DEX组NEC症状比NS组出现得更晚、更轻;与正常对照组相比,DEX组和NS组肠组织病理学评分及TLR4表达显著增高(P<0.05);与NS组相比,DEX组肠组织病理学评分及TLR4表达显著降低(P<0.05)。结论产前使用DEX对NEC大鼠具有保护作用,其机制可能是通过降低TLR4的表达从而发挥抗炎效应。     

骨形态形成蛋白对老龄性骨质疏松后骨缺损愈合的成骨促进作用

为了观察骨形态形成蛋白对老龄性骨质疏松性骨折愈合的成骨促进作用，作者选用２４月龄老龄大白鼠，凿去双侧胫骨上中１／３交界处相同部位的部分骨质，保留后侧骨皮质，以制成骨折缺损模型。严格配对后分成两组。一组骨缺损内注入小牛骨形态形成蛋白，另一组注入生理盐水作对照。通过对大鼠实验前后血清钙浓度、碱性磷酸酶活性、骨痂的数量和质量的观察，证实骨形态形成蛋白能刺激老龄鼠骨内成骨细胞活性，加快骨形成，提高骨质量，从而促进骨折缺损的愈合。     

骨髓基质干细胞对急性脊髓损伤大鼠模型神经功能修复的影响

目的探索骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）体外定向诱导分化为神经细胞后移植治疗急性脊髓损伤动物模型的疗效。方法对BMSCs进行体外诱导,并鉴定。将模型大鼠分为3组,将诱导及未诱导的BMSCs和生理盐水分别注入模型鼠脊髓半切点附近,在3个月内用BBB评分法对治疗情况进行评价。结果BMSCs体外诱导后的细胞经免疫组化检测可证实为神经细胞;进行细胞移植的两组动物死亡率明显下降,神经功能有明显恢复（P〈0.05）;并且BMSCs诱导后移植组神经功能恢复较未诱导组明显（P〈0.05）;而生理盐水组移植前后评分变化不明显。结论BMSCs诱导组治疗脊髓损伤模型的疗效总体好于未诱导的BMSCs组,前两组的疗效均好于生理盐水组。     

1,25-二羟基维生素D3对原发性骨质疏松骨折愈合影响的骨形态计量学研究

目的观察1，25-二羟基维生素D3（1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25（OH）2D5）对原发性骨质疏松骨折愈合中骨形态计量学的影响。方法通过对I型骨质疏松骨折模型和Ⅱ型骨质疏松骨折模型进行1，25（OH）2D3干预，8周后对骨痂组织进行形态计量学测定。结果在I型骨质疏松骨折模型和Ⅱ型骨质疏松骨折模型中，1，25（OH）2D3干预组的骨体积和骨小梁厚度均较无1，25（OH）2D3干预组显著提高（P〈0，05或P〈0．01），1，25（OH）2D3干预组的骨小梁间距较无1，25（OH）2D3干预组明显降低（P〈0．05或P〈0．01）。结论1，25（OH），D、对I型和Ⅱ型骨质疏松骨折愈合均有促进作用。     

唑来膦酸对鼠骨质疏松性骨折愈合及TGF-β表达影响的实验研究

目的研究唑来膦酸对去势大鼠骨质疏松性骨折愈合及转化生长因子（TGF-β）表达的影响。方法60只6月龄雌性SD大鼠建立骨质疏松性骨折模型后,将其随机分为实验组和对照组,分别给予唑来膦酸、生理盐水皮下注射。两组于术后不同时间段取骨痂行苏木素-伊红（HE）染色,测骨密度、免疫组化及x线片观察骨折愈合情况。结果实验组比同期对照组骨痂生成量多、愈合时间提前、骨折局部骨密度明显增高,差异有统计学意义（P〈0．05）。TGF—β于4周左右表达达到高峰,实验组比对照组TGF-β表达更明显（P〈0．05）。结论唑来膦酸能加快骨痂形成,促进成骨细胞TGF-β的表达,促进骨质疏松性骨折的愈合。     

中老年人骨转换标志物联合测定的指标分析

目的通过对存在骨质疏松等骨病患者血清骨标志物的测定,结合X线影像分析,探讨骨标志物在骨质疏松性疾病诊断中的表达及意义。方法收集2011年10月至2012年9月期间到我院就诊的骨病患者400例,骨质疏松组200例,骨折事件组200例,分别于早上7:00⁹:00进行静脉采血和X线摄影,血液样本同时测定骨转换标志物组合血清β-胶原降解产物(β-crosslaps)、N端骨钙素(N-MID)、甲状旁腺素(PTH),收集骨标志物结果和X线影像结果,对照X线影像结果进行分析。结果结合X线摄影结果判断,2组X线影片结果均显示存在不同程度的骨质退行性改变或骨质疏松症,骨折患者合并有骨质疏松性骨折表现。400例患者骨标志物组合显示,单独检测β-crosslaps阳性率占72.7%,N-MID阳性率占13.0%,PTH阳性率占7.5%。联合检测阳性率占75.5%。结论作为骨标志物,β-胶原交联C末端肽(β-CTX)可作为骨质疏松症的独立风险预测指标,联合测定或结合X线影像结果分析有利于提高骨质疏松症的风险评估。