结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP 10-ESAT-6或ESAT-6-CFP 10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP 10、ESAT～6基因。将CFP 10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后。构建CFP 10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）linker前，CFP 10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP 10融合基因，分别转化大肠杆菌XL 1—blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠肝菌BL21中表达，通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP 10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFPl0靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pETB2c（＋）-CFP 10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP 10融合蛋白，该蛋白兼具CFP 10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP 10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。     

重组结核杆菌分泌融合蛋白活性鉴定及应用

目的研究融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10免疫学特性.方法将一个柔性的氨基酸接头插入原核表达载体pET32c（＋）中,构建pET32c（＋）-linker.PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因.将CFP10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建载体pET32c（＋）的linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠埃希菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠埃希菌BL21中表达,通过Western blot分析其抗原性.结果 2个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后.重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致.融合蛋白在BL21菌中高效表达.Western blot分析表明,融合蛋白与活性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应.结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性.     

结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

目的构建结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活作用。方法用PCR技术特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,用PCR、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-ESAT-6。用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109b中,经表型筛选检测其自激活作用。结果获得了无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-ESAT-6。结论ESAT-6无自激活作用,可用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子。     

结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达与纯化及免疫原性检测

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核分枝杆菌esat-6基因,并构建到pGEX4T-1上,重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌esat-6基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,并经诱导后高效表达了ESAT-6融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

日本血吸虫p 50亲免素基因克隆、表达及纯化

目的扩增、原核克隆和表达日本血吸虫（Sj）p50亲免素基因全长cDNA，并进行表达产物的纯化。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框后，将其克隆入pET 30a（＋）原核表达载体中，异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果将Sjp50亲免素基因成功克隆入pET 30a（＋）表达载体中；诱导表达并成功纯化出重组Sjp50亲免素蛋白。结论成功克隆sjp50亲免素基因，并表达和纯化得到了p50亲免素蛋白，为研究Sip50亲免素的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础。     

球形幽门螺杆菌vacA基因表达质粒构建及表达

目的构建球形幽门螺杆菌vacA基因的重组表达质粒,初步观察其在E.coli中的表达。方法采用亚克隆技术,用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-vacA上切下vacA基因,插入表达载体pET32a（＋）质粒,转化大肠埃希菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a（＋）-vacA转化大肠埃希菌,（IPTG）诱导表达后进行（SDS-PAGE）电泳和凝胶扫描定量分析。结果重组质粒酶切和PCR鉴定与预期结果相符,成功构建携带vacA基因的重组原核表达质粒pET32a（＋）-vacA。核酸序列测定及同源性分析证实,表达质粒pET32a（＋）-cagA中所含vacA基因与GenBank中的vacA序列同源性达到99.2%。vacA基因在大肠埃希菌中诱导表达后获得约156 kD蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量15.5%。结论成功构建球形H.pylori vacA基因重组表达质粒,并获得高效表达,为研究该基因蛋白的生物学特性及DNA疫苗研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a（＋）与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a（＋）载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta （DE3）,用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni＋-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a（＋）与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.     

结核分枝杆菌CFP10 ESAT6重组融合蛋白抗原血清学诊断价值

目的研究重组CFP10 ESAT6蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,探寻更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rCFP10 ESAT6蛋白,通过酶联免疫吸附试验检测192例健康者和210例结核病患者血清与纯化rCFP10 ESAT6的抗体反应。结果 rCFP10 ESAT6蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25％,分子量约为28 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为30.10％(31/103)和28.97％(31/107),总的灵敏度为29.52%(62/210);在192例健康者血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为2.11%(2/95)和6.19%(6/97),总的特异性为95.83%(184/192)。结论rCFP10 ESAT6蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌H37Rv株重组抗原ESAT-6的表达纯化研究

目的表达纯化结核分枝杆菌(简称:结核杆菌)H37Rv株重组抗原ESAT-6,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b-ESAT-6转化E.coli表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导重组抗原ESAT-6表达。经SDS-PAGE电泳和Western印迹鉴定后,优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱纯化重组抗原。结果成功构建了重组质粒pET23b-ESAT-6并且重组抗原ESAT-6以可溶性形式高效表达,经亲和层析后得到高纯度有免疫原性的重组抗原(纯度>95%)。结论高纯度有免疫原性的重组抗原ESAT-6为新型亚单位疫苗的研发及其结核病血清学诊断价值研究奠定了基础。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白32的克隆表达及血清学检测

目的 构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白32(culture filtrate protein 32,CFP32)的重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白CFP32,探讨其对结核病的诊断价值.方法 通过聚合酶链反应技术从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出Rv0577基因,将其克隆到pMD18一T载体后,再亚克隆到表达载体pET21a,在大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经纯化及复性后,通过Western blot分析,并以酶联免疫吸附试验检测160例血清抗体,其中肺结核患者97例、非结核肺部疾病患者25例,正常对照38名.结果 构建了CFP32重组质粒,并在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白经SDSPAGE分析,在约相对分子质量30 000处有表达条带,镍柱纯化后的重组蛋白占总蛋白的90%以上.Western blot证实重组蛋白可以与结核患者血清特异结合.并以此蛋白进行160份血清结核抗体检测,结果敏感度为63.9%(62/97),特异度为96.8%(2/63).结论 成功构建pET21a-CFP32表达载体,并在大肠杆菌中高效表达CFP32蛋白,对其血清抗体检测证明重组的CFP32蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一.     

Analysis of complex formation and immune response of CFP-10 and ESAT-6 mutants

ESAT-6 and CFP-10 form a 1:1 heterodimeric complex which contributes to the virulence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Based on the structure of CFP-10-ESAT-6 complex, we have selected four point mutations each of CFP-10 and ESAT-6 and have analyzed complex formation for the 25 possible combinations between wild-type and mutant CFP-10 and ESAT-6 proteins. We observed that the mutations L25R or F58R of CFP-10 and L29D or L65D of ESAT-6 lead to disruption of complex formation. We have evaluated the immunogenic responses of the wild-type and mutant CFP-10 and ESAT-6 proteins, the wild-type CFP-10-ESAT-6 complex, six complex-forming and two non-complex-forming combinations of wild-type/mutant CFP-10 and ESAT-6 proteins. CFP-10 mutants I21R, L25R, and W43R were found to have better immunogenic potential than wt-CFP-10, while none of the ESAT-6 mutants were better than wt-ESAT-6. Very interestingly, we have discovered that the non-complex-forming mixture of CFP-10-I21R and ESAT-6-L29D gives a strong immunogenic response.     

Recombinant DNA vaccine of the early secreted antigen ESAT-6 by Mycobacterium tuberculosis and Flt3 ligand enhanced the cell-mediated immunity in mice

Cell-mediated immune (CMI) responses are crucial in the protection against tuberculosis. 6-kDa early secretary antigenic target (ESAT-6) is an important T-cell antigen recognized by protective T cells in animal models of infection with Mycobacterium tuberculosis. Flt3 ligand (FL) is a growth factor of dendritic cell (DC), which, as a powerful antigen presenting cell (APC), is essential for CMI response. In this study, we constructed a recombinant DNA vaccine encoding ESAT-6 and FL. The recombinants were identified by restriction enzyme digestion and sequence analysis. Subsequently, the recombinants were transfected into glomerular mesangial cells (GMCs) of rat. The expressed proteins were detected by Western blot. C57BL/6 female mice were immunized three times with the recombinant plasmids. The results showed that immunization with pIRES-ESAT-6 plasmid induced an obvious T-cell response compared with controls (mice immunized with PBS, pIRES or BCG). However, mice immunized with pIRES-ESAT-6-FL presented a more stronger T helper 1 (Th1)-biased response, accompanied by higher levels of lymphocytes proliferation, elevated production of Th1 cytokines (IFN-gamma and IL-2) by spleen cells, as well as increased specific antibody in sera, together with lower levels of Th2 cytokines (IL-4 and IL-10). Our results suggested that EAST-6 was a useful vaccine candidate and FL might be a powerful adjuvant, which could effectively promote T cell-mediated immune response.