幽门螺杆菌cheA基因在细菌体外趋化和体内定植过程中的作用

目的 了解cheA基因在幽门螺杆菌体外趋化和体内定植中的作用.方法 从幽门螺杆菌NCTC11637株基因组DNA中扩增并克隆全长cheA和cheY基因.构建该两个基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取目的 重组蛋白rCheA和rCheY.rCheA和rCheY免疫家兔制备抗血清,采用硫酸铵沉淀法及DEAE-52柱层析法制备rCheA-IgG和rCheY-IgG.构建cheA基因自杀质粒,根据同源重组交换原理利用该自杀质粒构建cheA基因敲除突变株(cheA-),采用PCR及测序对cheA-突变株进行鉴定.采用rcheA-IgG和rCheY-IgG锚定靶蛋白及蛋白磷酸化检测试剂盒,测定cheA-突变株与野生株CheA和CheY分子磷酸化水平.采用幽门螺杆菌趋化模型及BALB/c小鼠感染模型,比较cheA-突变株与野生株体外趋化及体内定植能力的差异.结果 PCR及测序结果证实cheA-突变株基因组中cheA基因被敲除.0.001～0.1 mol/L盐酸作用10 min,野生株CheA和CheY磷酸化水平分别从(59.6±11.5)和(55.5±10.2)μmol迅速下降至(10.8±2.6)和(5.5±1.2)μmol(P＜0.05),cheA-突变株CheY磷酸化水平均较低且无明显变化(P＞0.05).cheA-突变株对盐酸、硫酸和乙酸趋化聚集环直径[(10～20)±(2～3)mm]明显小于野生株[(16～24)±(2～3)mm],P＜0,05.野生株感染小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率(90%)明显高于cheA-突变株(40%),P＜0.05;荧光定量PCR结果也显示野生株感染小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌数量(6.3×103±2.1×103拷贝/mg)也明显高于突变株的(8.3×101±3.1 ×101拷贝/mg),P＜0.05.结论 cheA基因在幽门螺杆菌体外趋化和体内定植中有促进作用.     

幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的　构建含幽门螺杆菌 (Hp)Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的重组载体 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法　用PCR从Hp染色体中 ,扩增Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接后 ,构建含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL2 1(DE30 )并表达。表达产物经纯化后 ,用ELISA法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpMr 2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因 ,与Tomb等的报道相比较 ,有 1.1%的bp发生变异 ,1.5 1%的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 4 6× 10 3 ,可溶性表达产物占细菌总蛋白的 38.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。ELISA法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良好的抗原性。结论成功地克隆并表达Mr为 2 6 0 0 0的Hp外膜蛋白编码基因 ,为Hp蛋白疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础     

人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达

目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a( )分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a( ) /HspA和pET32a( ) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a( ) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a( )表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0 0OMP单     

幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

人单核细胞趋化蛋白—15‘端翻译起始区的改构及其表达

应用ＰＣＲ技术优化人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）基因的５‘端翻译起始区，并半其亚克隆入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中，经ＤＮＡ测序证实优化成功，且在大肠杆菌中表达出ＭＣＰ－１蛋白，表达产物的占菌体总蛋白的１０％左右，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明，表达产物可与ＭＣＰ－１抗体发生特异性反应。     

幽门螺杆菌结构性群体形成的研究

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)由浮游状单细胞转变成结构性群体过程中蛋白质表达差异。方法 用超微结构形态观察及双向电泳技术比较浮游状幽门螺杆菌及其结构性群体全菌蛋白表达图谱的差异，将结构性群体形成过程中表达量显著增加的蛋白斑点，进行胶内酶切，肽混合物使用基质辅助激光解吸，电离飞行时间质谱仪进行质谱分析，获得4个明确的肽质量指纹谱，通过蛋白质数据库进行检索分析。结果 与结构性群体形成密切相关的蛋白质为鞭毛丝帽蛋白、2-磷酸甘油酸醋脱水酶、3，和邻苯二酚-2-丁酮4-磷酸盐合成酶和热休克蛋白33同类物。结论 上述蛋白的鉴定将有助于发现幽门螺杆菌新的致病因子以及抗菌靶位。     

幽门螺杆菌GroEL蛋白重组表达及表达产物小鼠免疫保护作用

目的 检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异,确定重组表达的GroEL蛋白(r-GroEL)抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性.方法 采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列.构建幽门螺杆菌groEL基因pET42a-E.coli BL21DE3原核表达系统,采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统确定rGroEL表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用ELISA和Western blot检测rGroEL的抗原性和免疫反应性,采用幽门螺杆菌全菌为包被抗原的ELISA确定GroEL膜定位.采用幽门螺杆菌小鼠感染模型了解rGroEL免疫保护作用.结果 35株幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列相似性高达99.4％～ 100％.rGroEL表达量可达细菌总蛋白的56％,SDS-PAGE后提纯的rGroEL在凝胶中显示为单一的条带.rGroEL可诱导家兔和小鼠产生高效价IgG抗体,同时也能被幽门螺杆菌全菌抗体(Hp-IgG)或rGroEL-IgG识别并与之结合.GroEL是幽门螺杆菌表面蛋白抗原.50、100或200 μg rGroEL免疫可分别使50.0％ (6/12)、75.0％ (9/12)和91.7％ (11/12)小鼠免于幽门 螺杆菌SS1株的感染,200 μg rGroEL免疫保护率(91.7％)显著高于50μg rGroEL(50.0％)( P＜0.05).结论 幽门螺杆菌GroEL蛋白是序列保守、具有良好免疫原性和免疫保护性的表面抗原,可作为基因工程疫苗候选抗原.     

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段原核表达载体的构建和表达

目的 构建幽门螺杆菌（Hp)vac A基因片段原核表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术,扩增Hp vac A基因的1个片段B,并克隆入pGEM－3Zf(-)质粒。测序正确后,再克隆入质粒pRSETA中,构建重组表达载体pRSETA-B。结果 经过转化E.coli BL21 DE3(plysS)后,诱导表达出相对分子质量（Mr)为33000的蛋白。SDS－PAGE分析显示,表达量占全菌总蛋白质的47．8％。清中目的蛋白占全菌总蛋白的10．9％。ELISA和Western blot分析表明,表达蛋白能与免抗Vac A多抗结合。结论 成功地构建原核表达载体pRSETA-B,为进一步探讨该片段的生物学活性,以及临床上通过检测患者血清预测Hp的感染提供了实验依据。     

猪幽门螺杆菌样细菌与人幽门螺杆菌关系的初步研究

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）技术和免疫印迹分析，初步对人幽门螺杆菌（Ｈｐ）与猪幽门螺杆菌样细菌（ＨｐＬＯ）进和了比较研究。结果发现，Ｈｐ与猪ＨｐＬＯ具有不同的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱，但猪ＨｐＬＯ的４８ｋＤ、６２ｋＤ蛋白与Ｈｐ的５１ｋＤ蛋白间有明显的交叉免疫反应，说明猪ＨｐＬＯ不是人Ｈｐ的传染源，但猪感染ＨｐＬＯ后可能会产生与Ｈｐ起交叉反应的高滴度循环抗体。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

空肠弯曲菌mcp1/2/3基因原核表达及其产物与细菌趋化作用的相关性

目的 克隆空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)接受甲基趋化蛋白(MCP)编码基因mcp1、mcp2和mcp3并构建其原核表达系统,建立空肠弯曲菌体外趋化模型并确定趋化诱导物质,了解MCPs与趋化诱导物之间的关系.方法 PCR扩增mcp1、mcp2和mcp3基因片段,T-A克隆后测序.构建上述目的 基因原核表达系统,SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶成像分析系统检查目的 重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rMCPs.rMCPs免疫家兔获得抗血清,免疫扩散法测其效价.用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG,经胃蛋白酶酶解和Sephedex G-100层析制备IgGF(ab')2.建立HAP(hard-agar plus)法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用.采用基于IgG F(ab')2封闭的趋化阻断试验,确定不同MCPs的功能及其差异.结果 PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mop3基因片段,其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPs,其产量均约为细菌总蛋白的10%.rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体,其免疫扩散效价均为1∶4.牛胆汁和脱氧胆酸钠(DOC)对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用(P<0.05).MCP1和MCP2被其IgG F(ab')2 封闭后,空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱(P<0.05),MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响(P>0.05).结论 本研究成功地表达了空肠弯曲菌MCPs蛋白.牛胆汁和DOC是诱导空肠弯曲菌趋化的信号物质,MCP1和MCP2可能参与该菌对DOC的趋化过程.     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的　构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)的重组融合蛋白 ,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩增出 1713bp的ureB基因 ,并克隆至pFS2 .2载体中与ltB基因融合 ,将ltB ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa Ⅱ ,并在工程菌E .coliJM10 9中诱导表达。结果　经序列分析 ,ltB ureB融合基因由 2 10 3个碱基组成 ,为编码 70 1个氨基酸残基的多肽。SDS PAGE和Westernblot检测发现 ,融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 75× 10 3 ,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应 ,ELISA检测显示 ,融合蛋白中存在LTB组分。同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性 ,但保持与LT受体 神经节苷脂GM1结合的活性。结论　LTB UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp)细胞毒素相关蛋白（CagA)及粘膜免疫佐剂量霍乱毒素B亚单位（CTB）的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法：用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段，从霍乱弧菌扩增CTB基因片段，将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在JM109DE3中表达。结果：重组质粒pEGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符；各表达蛋白经SDS－PAGE分析，相对分子量与文献相符；重组蛋白经Westem blot检测有较强的抗原性。结论：基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备。     

Humoral and cellular immune recognition of Helicobacter pylori proteins are not concordant.

Helicobacter pylori is a major cause of chronic antral gastritis and peptic ulcer disease. Further definition is needed of the factors that determine whether infected individuals remain asymptomatic, or ultimately develop ulceration of the mucosa or transformation to malignancy. To explore the possibility that host response to H. pylori may play a role in the outcome of this infection, we have examined humoral and cellular recognition of several H. pylori proteins by seropositive and seronegative persons. A complex mixture of water-extractable cell proteins, which did not include lipopolysaccharide (LPS), was recognized by serum antibodies only in seropositive or infected individuals. IgG from seropositive subjects also bound to urease and to a heat shock protein (hsp)60 that is homologous to the 65-kD mycobacterial heat shock protein, while sera from uninfected individuals were negative. Although antibody responses to these antigens were restricted to seropositive subjects, T cell recognition of the same proteins was found in both seropositive and seronegative subjects. The water extract of H. pylori stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from all subjects, while purified proteins activated lymphocytes of only some seropositive and seronegative subjects. PBMC that were activated by the H. pylori hsp60 did not respond to the autologous human p60 heat shock protein. These results demonstrate that, in contrast to antibody responses, T cell recognition of H. pylori proteins may occur in non-infected persons. In addition, the data suggest that in these subjects, peripheral lymphocytes that are activated by bacterial heat shock proteins do not mediate tissue damage by recognition of human heat shock homologues.     

趋化性细胞因子MTCK1/mPBP的原核表达、纯化及活性分析

目的 原核表达、纯化小鼠CXC亚家族趋化性细胞因子MTCK1／mPBP并测定其生物学活性。方法 构建原核表达载体pQE-30-MTCK1/mPBP；在大肠杆菌M15菌株中表达重组蛋白6xHisMTCK1/mPBP，利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。采用Boyden小室对纯化的MTCK1／mPBP蛋白进行趋化活性分析。结果 通过优化表达和纯化条件，获得了重组．MTCK1／mPBP蛋白，并对大肠杆菌包涵体蛋白进行变性和复性处理。趋化试验表明，原核表达的MTCK1／mPBP蛋白对转染有CXCR2受体的293细胞系具有明显的趋化能力，并呈现浓度依赖性。结论 利用原核表达系统，表达并纯化了重组趋化性细胞因子6xHis-MTCK1／mPBP蛋白，体外功能试验证实有生物学活性．