无细胞蛋白合成体系实现胰岛素原可溶性表达

胰岛素原(Proinsulin,Pins)是胰岛素的合成前体。在大肠杆菌表达系统中,其一般以包涵体的形式存在,需要经过变性复性等后续加工过程才能得到有活性的胰岛素。而无细胞蛋白合成体系(Cell-free protein synthesis,CFPS)作为一种新型体外蛋白合成手段,突破了细胞的生理限制,已成功应用于多种重组蛋白药物的生产。为了探索胰岛素合成的新方法以满足其在新型给药途径研发中的需求,本研究运用CFPS体系进行胰岛素原的可溶性表达。通过将胰岛素原与荧光蛋白进行融合来增加其可溶性,成功在CFPS体系中表达了胰岛素原融合蛋白。最后使用Western blotting对融合红色荧光蛋白的胰岛素原(Pins-mCherry)进行鉴定,利用酶标仪对融合绿色荧光蛋白的胰岛素原(Pins-eGFP)在上清中的表达进行定量分析,结果表明Pins-eGFP部分可溶,其表达量为(12.28±3.45)μg/m L。本研究首次实现了融合胰岛素原在CFPS系统中的可溶性表达,其融合荧光蛋白的策略显著提升了胰岛素原的可溶性,该结果为探究胰岛素合成新方法及开发基于CFPS系统的新型胰岛素给药途径奠定了基础。     

无细胞合成生物学：革新生物医药产业的新策略

无细胞合成生物系统,能够在体外完成生命转录翻译过程,因体系灵活开放、便于控制、表达周期短、高耐受性等特点,可表达细胞系统难以表达的蛋白质。随着无细胞生物传感和体系冻干技术的不断发展,其在医药健康领域的应用不断拓展。本文综述了无细胞合成生物学在按需生物医药合成和便携式医疗检测等医药健康领域的研究进展,该体系的进一步发展有潜力实现更复杂后修饰蛋白质药物的合成、可丰富无细胞生物传感器类型并提高其灵敏性。无细胞合成生物学作为新兴工程策略,未来必将更好地应用于高通量医药蛋白质筛选、新型病原体的检测等医药健康领域。     

无细胞蛋白质合成系统

无细胞蛋白质合成系统相比传统的细胞表达系统有许多优点,包括表达周期短、反应条件容易控制等。该文介绍了无细胞蛋白质合成系统的技术进展及表达控制,并综述了这一系统的应用发展。     

无细胞系统的基因表达与蛋白质合成

无细胞翻译——利用细胞提取液在体外合成蛋白质,已是国外分子生物学实验室的一项常规技术,但在国内此项技术的利用却几乎是空白.对体外无细胞系统的特性、功能、优缺点及其进展等进行了全面的介绍,以期使国内学者了解和利用这一方便而有效的表达系统,进行应用生物化学与分子生物学的实验研究.     

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌中结合磷酸化的TRAFs

 对鼻咽癌中潜伏膜蛋白 1 (LMP1 )是否结合磷酸化的肿瘤坏死因子受体相关因子 (tumornecrosis factor receptor- associated factors,TRAFs)信号分子进行探讨 .首先应用 CSA/SP双染色法在 30例鼻咽癌活检组织中发现 1 6例 (52 % ) LMP1与 TRAF1、TRAF2和 TRAF3共表达于癌细胞胞膜及胞浆同一部位 .这提示 EB病毒 LMP1在鼻咽癌中可能结合 TRAF1、TRAF2或TRAF3发挥作用 .进一步以导入载体 p SG5的鼻咽癌细胞系 HNE2 - p SG5为对照 ,建立了稳定表达 LMP1的鼻咽癌细胞系 HNE2 - LMP1 ,利用这两种细胞系 ,以免疫共沉淀 - Western印迹方法 ,证实了 LMP1可与磷酸化的 TRAF1、TRAF2或 TRAF3直接或间接作用形成免疫共沉淀复合物 .     

无细胞体系非天然蛋白质合成研究进展

无细胞非天然蛋白质合成作为蛋白质研究的新兴手段,已成功用于表征蛋白质分子间、蛋白质与核酸分子间相互作用等基础科学研究及医药蛋白、蛋白质材料等工业生产领域。无细胞非天然蛋白质合成系统不需维持细胞的生长,无细胞膜阻碍,可依据研究目的添加基因元件或化学物质从而增强工程设计和过程调控的自由性;也可赋予蛋白质新的特性、结构及功能,如可实现蛋白翻译后修饰、反应手柄引入、生物物理探针及多聚蛋白质合成等。文中系统地综述了目前应用于无细胞蛋白质合成系统中的非天然氨基酸嵌入方法,包括全局抑制及基于正交翻译体系的终止密码子抑制、移码抑制、有义密码子再分配和非天然碱基等方法的研究进展,及非天然氨基酸在蛋白质修饰、生物物理探针、酶工程、蛋白质材料以及医药蛋白质生产等领域的应用进展,并分析了该体系的发展前景及广泛工业化应用的机遇与挑战。     

无细胞蛋白合成系统的研究进展

无细胞蛋白合成系统能够以DNA或RNA为模板直接在体外合成蛋白,通过种种技术改进,在某些个例中,蛋白表达量已接近体内表达水平,并且建立了翻译后修饰和蛋白纯化的方法,进一步提高无细胞系统的合成能力,会使它比重组细胞的工业生产更具竞争力。     

自组装蛋白质芯片——功能蛋白质组学的新工具

传统的蛋白质芯片制备需要进行繁琐的蛋白质表达与纯化。同时,由于蛋白质活性不稳定,蛋白质芯片不宜长期保存。新一代自组装蛋白质芯片,利用无细胞表达体系和DNA固定技术,能够将蛋白质即时、原位表达并固定在芯片上,有效地解决了传统蛋白质芯片的制备和保存问题。目前自组装蛋白质芯片已初步用于大规模蛋白-蛋白质相互作用的筛选,以及鉴定免疫优势抗原等研究。该文介绍了近年自组装蛋白质芯片技术的进展和应用研究。     

无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达体系是一种以细胞抽提物为基础的体外合成蛋白质表达技术,具有遗传背景简单、反应操控简便等特点,已成为研究生物反应系统的重要技术手段。在研究人员的不断努力下,反应体系从原核扩展到真核蛋白质合成体系,而且目标蛋白表达量从毫克级提高到数克级每升,成本不断降低,反应规模可达到百公升级。近年来,无细胞蛋白表达系统在复杂蛋白、毒性蛋白和膜蛋白表达方面的优势逐渐体现,展示了其在生物制药领域的重要应用潜力。总之,无细胞技术已经成为异源蛋白质高效合成和生物制药领域中有巨大潜力的新策略。     

爪蟾卵无细胞系统中核的自组装和组装核染色质纤维的研究

以人工促排的非洲爪蟾卵为材料制备体外无细胞系统,加入Lambda DNA或染色质,用荧光显微镜和电子显微镜观察核的自组装现象.在核的自组装过程中可以看出由丝状、不规则块状到小球状的形态变化,直至形成与真核细胞间期核的形态、结构相似的组装核.在加入染色质时,所观察到的现象和加入Lambda DNA时相似,但形成组装核的过程较快.组装核经过适当浓缩后,以低渗铺展法使其破裂,从核中释放的染色质纤维,电镜观察与细胞核内的染色质有相似之处也有其本身的特点.用蛋白酶处理,纤维变得光滑,其上的颗粒消失;DNase的作用则可使纤维消失,只剩下一些颗粒和片段;RNase处理时没见变化.     

Assembling a Correctly Folded and Functional Heptahelical Membrane Protein by Protein Trans-splicing

Protein trans-splicing using split inteins is well established as a useful tool for protein engineering. Here we show, for the first time, that this method can be applied to a membrane protein under native conditions. We provide compelling evidence that the heptahelical proteorhodopsin can be assembled from two separate fragments consisting of helical bundles A and B and C, D, E, F, and G via a splicing site located in the BC loop. The procedure presented here is on the basis of dual expression and ligation in vivo. Global fold, stability, and photodynamics were analyzed in detergent by CD, stationary, as well as time-resolved optical spectroscopy. The fold within lipid bilayers has been probed by high field and dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR utilizing a ¹³C-labeled retinal cofactor and extensively ¹³C-¹⁵N-labeled protein. Our data show unambiguously that the ligation product is identical to its non-ligated counterpart. Furthermore, our data highlight the effects of BC loop modifications onto the photocycle kinetics of proteorhodopsin. Our data demonstrate that a correctly folded and functionally intact protein can be produced in this artificial way. Our findings are of high relevance for a general understanding of the assembly of membrane proteins for elucidating intramolecular interactions, and they offer the possibility of developing novel labeling schemes for spectroscopic applications.     

膜蛋白LASS2的表达研究

利用多种原核表达系统、真核体外翻译系统和细菌/杆状病毒(Bac to Bac)的昆虫表达系统对一个具有重要生理功能的人的膜蛋白LASS2(Homo sapienslongevity assurance homologue 2 of yeastLAG1)进行表达研究。在原核表达系统中仅能够表达其羧基端胞外区片段却不能表达完整的LASS2蛋白,并制备了该片段的抗体。完整的LASS2蛋白能够在两种真核表达系统中进行表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物分子量为约28kD的LASS蛋白, Western印迹分析也证实了这一结果, 并利用Ni-NTA树脂亲和层析将该蛋白纯化,纯度达到90%以上。     

脑内膜雌激素受体信号转导与窖蛋白

雌激素受体在脑内分布十分广泛,对脑功能具有重要作用。雌激素可以通过膜雌激素受体启动的信号转导通路(非基因组效应)作用于中枢神经系统的很多部位,而窖蛋白(caveolin)可以通过不同方式参与膜雌激素受体介导的脑功能调节。简要综述了脑内膜雌激素受体介导的信号转导通路与窖蛋白相关的研究进展。     

Protein kinase C and receptor kinase gene expression in olfactory receptor neurons

Recent biochemical evidence indicates that protein kinase C (PKC) and G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) are involved in olfactory signal termination and desensitization. The polymerase chain reaction (PCR) was used to investigate the expression of PKC and GRK genes in olfactory tissue and in isolated olfactory receptor neurons from channel catfish (Ictalurus punctatus). Sequence analysis of cloned PKC PCR products showed that the α, β, δ, ϵ, and τ isotypes were expressed in olfactory tissue. Sequence analysis of PCR products obtained from isolated olfactory receptor neurons showed that PKCβ and PKCδ were expressed in the receptor cells. A 600-bp GRK PCR product was obtained from isolated olfactory neurons that shared 86% and 92% amino acid sequence identity to the mammalian β-adrenergic receptor kinase gene products βARK1 and βARK2, respectively. Go6976, a specific inhibitor of calcium-regulated PKC activity, completely inhibited odorant-stimulated PKC activity in isolated olfactory cilia. This result suggested that odorant-stimulated PKC activity is mediated by the calcium-sensitive PKCβ isotype. Taken together, these results are consistent with the conclusion that PKCβ and βARK mediate odorant receptor phosphorylation and olfactory signal termination. © 1997 John Wiley & Sons, Inc. J Neurobiol 33: 387–394, 1997     

利用昆虫杆状病毒表达SARS冠状病毒的刺突蛋白和膜蛋白

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。对其他种类冠状病毒的研究结果显示,刺突蛋白(S蛋白)和膜蛋白(M蛋白)是病毒主要的结构蛋白。重组M蛋白和S蛋白可被用来作为抗原检测冠状病毒的感染和制备疫苗。这两个蛋白质分别被克隆并重组到昆虫杆状病毒基因组中,利用重组杆状病毒感染昆虫细胞来表达重组M蛋白和S蛋白,并对M蛋白进行了细胞内定位,融合蛋白的绿色荧光暗示了该蛋白质定位在细胞膜上。     

细胞质膜蛋白与肿瘤的相关性研究进展

肿瘤相关研究一直是科研领域的重点与难点。肿瘤的发生、发展和转移与细胞质膜蛋白关系密切,质膜蛋白的过量表达、缺失或修饰,使细胞的信号转导、物质运输、黏附作用、免疫原性等发生改变,从而影响了肿瘤细胞的上述过程。简要综述了相关领域的研究进展。     

Adrenocorticotropic Hormone (ACTH) Responses Require Actions of the Melanocortin-2 Receptor Accessory Protein on the Extracellular Surface of the Plasma Membrane

The melanocortin-2 (MC2) receptor is a G protein-coupled receptor that mediates responses to ACTH. The MC2 receptor acts in concert with the MC2 receptor accessory protein (MRAP) that is absolutely required for ACTH binding and signaling. MRAP has a single transmembrane domain and forms a highly unusual antiparallel homodimer that is stably associated with MC2 receptors at the plasma membrane. Despite the physiological importance of the interaction between the MC2 receptor and MRAP, there is little understanding of how the accessory protein works. The dual topology of MRAP has made it impossible to determine whether highly conserved and necessary regions of MRAP are required on the intracellular or extracellular face of the plasma membrane. The strategy used here was to fix the orientation of two antiparallel MRAP molecules and then introduce inactivating mutations on one side of the membrane or the other. This was achieved by engineering proteins containing tandem copies of MRAP fused to the amino terminus of the MC2 receptor. The data firmly establish that only the extracellular amino terminus (N_out) copy of MRAP, oriented with critical segments on the extracellular side of the membrane, is essential. The transmembrane domain of MRAP is also required in only the N_out orientation. Finally, activity of MRAP-MRAP-MC2-receptor fusion proteins with inactivating mutations in either MRAP or the receptor was rescued by co-expression of free wild-type MRAP or free wild-type receptor. These results show that the basic MRAP-MRAP-receptor signaling unit forms higher order complexes and that these multimers signal.     

前列腺素核受体系统信号转导及基因表达调控

脂肪酸和前列腺素等脂代谢的产物不仅通过膜受体起作用,也可以通过与核受体结合来调节基因表达.前列腺素I₂(PGI₂)既可以与G蛋白偶联的细胞表面IP受体起作用,也可以通过核受体过氧化物酶体增殖因子活化受体（PPARs）发挥生物学功能.前列腺素E₂(PGE₂)的受体（EPs）不仅仅在质膜上有,最近在核膜上也发现了EPs受体.前列腺素核受体介导的信号转导途径与膜受体介导的信号途径不同,对于基因转录的调控机制也不同.