血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列,采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T,筛选正确的质粒后,再亚克隆至pcDNA3.1（＋）。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞,通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示,转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。     

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的　克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法　提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果　获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论　我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究 BPI生物学功能奠定了基础     

MIG(CXCL9)表达载体构建及体外活性鉴定

目的构建MIG（CXCL9）真核表达载体,为利用MIG研究肿瘤基因治疗奠定基础。方法从pBLAST-MIG上切下含MIG全长的cDNA序列,定向插入pORF-mcs真核表达质粒,构建pORF-MIG重组质粒;然后经酶切分析和测序鉴定后,通过脂质体介导转染COS-7细胞;再进一步用免疫印迹法鉴定重组质粒的表达活性,用趋化试验鉴定生物学活性。结果pORF-MIG重组质粒经酶切分析和测序证实含有MIG的全长cDNA序列,转染COS-7细胞后高效表达MIG蛋白,对活化的淋巴细胞有趋化作用。结论成功构建了MIG（CXCL9）真核表达质粒,为进一步利用pORF-MIG研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。     

真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法：用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC,胶回收约410bp的SLC基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,用Western blot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果：菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实,mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Western blot检测表明,以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC,表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论：成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC,用它转染COS-7细胞后,能瞬时表达mSLC,为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.     

大鼠Neurogenesin-1基因真核表达载体的构建及在cos-7细胞中的表达

目的 克隆大鼠海马中Neurogenesin-1(Ng1)基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Ng1真核表达载体,并检测其在cos-7细胞中的表达,为进一步研究该基因对脊髓神经干细胞分化的影响提供实验依据.方法 在无RNA酶污染的条件下提取出大鼠海马总RNA.利用逆转录聚合酶链反应扩增出Ng1基因片段.将该基因片段连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选,双酶切鉴定后送测序.将构建成功的重组真核表达载体转染入cos-7细胞,Western blot鉴定重组Ng1蛋白的表达. 结果 逆转录聚合酶链反应成功获得大鼠Ng1 cDNA.随机挑选10个重组真核表达载体的克隆,聚合酶链反应筛选出阳性克隆2个,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功.脂质体介导转染cos-7细胞48 h后,Western blot鉴定重组Ng1蛋白在cos-7细胞中的表达,在46 ku处出现阳性条带. 结论 大鼠海马Ng1基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Ng1构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Ng1蛋白.     

SARS冠状病毒核蛋白与mGM-CSF融合质粒的构建及表达

目的构建SARS冠状病毒(SARS—COV)核蛋白(N)与mGM—CSF的融合真核表达质粒,借助mGM—CSF的免疫佐剂作用,提高SARSDNA疫苗的免疫效果。方法采用PCR方法扩增N和mGM—CSF基因片段,用分子克隆和基因融合的方法将目的片段定向插入真核表达载体中,构建融合表达质粒pVAX 1／N—mGM—CSF,并以融合质粒转染细胞,用免疫细胞化学和Western Blot的方法鉴定融合质粒在体外的表达。结果经酶切鉴定及DNA序列测定证实融合质粒构建正确,细胞转染实验表明,融合质粒能在COS-7细胞中表达。结论成功构建SARS—COV核蛋白与mGM—CSF的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

目的: 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法: 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N-末端带上含24 bp的flag标签,克隆到pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-cbl在细胞中的表达. 结果: 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flag-cbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒pcDNA3.1( )-flag-cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.结论: 成功构建了N-末端带flag标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

Construction and identification of eukaryotic eukaryotic expression plasmid pcdna3.1-bace and its transient expression in cells

Objective： To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods： A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy：mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results： The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion： The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer＇s disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly.     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

人CD38分子基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆并表达人CD38抗原分子的全长cDNA。方法：采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中克隆出CD38全长cDNA并将其插入pGEM-T载体中，重新设计引物，引入酶切 位点，二次PCR；从重组pGEMT载体上扩增CD38抗原分子的cDNA编码序列，再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，用脂质体法转染COS7细胞。用免疫荧光及A－PAAP方法检测CD38抗原的表达。结果：克隆的CD38抗原的全长cDNA，经酶切鉴定及序列分析表明，其序列与文献报道完全一致。免疫荧光及APAAP方法检测表明，CD38抗原分子在COS7细胞中获得表达。结论：成功构建了CD38真核表达载体，并在COS7细胞中获得表达，对研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人血管内皮生长因子-C基因的体外重组和表达

目的体外重组人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因,检验其在细胞中的表达。方法以RT-PCR法从人真皮成纤维细胞中克隆VEGF-C基因功能片断的cDNA,制备pcDNA3.1( )-VEGF-C质粒载体,通过Fugene 6介导转染人成纤维细胞及COS7细胞。RT-PCR及免疫组化法检测VEGF-C基因表达情况。结果从成纤维细胞中克隆得到1 053 bp的VEGF-C基因cDNA,碱基序列与已知的人VEGF-C基因cDNA完全一致。重组pcDNA3.1( )-VEGF-C质粒所携带的目的基因VEGF-C在细胞中有强表达。结论成功重组了一个pcDNA3.1( )-人VEGF-C质粒,为进一步研究淋巴水肿的基因治疗提供了物质基础。     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。