胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞的培养及鉴定

目的:探讨胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的分离、培养、传代及鉴定的方法。方法:分离E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织,用机械吹打方法形成细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(ep i-derm al growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(fibrob last growth factor-basic,bFGF)、B27(B27 sup lem ent)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并且进行B rdu和Nestin检测;然后取培养细胞诱导分化后行GFAP,NeuN,TH检测。结果:E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织细胞培养两周后可以形成较多的悬浮生长的神经球,经单细胞克隆和传代扩增后得到大量的同源细胞克隆球。经过B rdu和Nestin的免疫细胞化学检测90%以上的细胞呈阳性;诱导分化后细胞呈GFAP,NeuN阳性,少量细胞呈TH阳性。结论:从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是胚胎大鼠中枢神经系统的NSCs,并可以分化为TH阳性神经元。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法。方法:新生大鼠大脑皮层通过胰酶消化获取单细胞悬液,用台盼蓝染色鉴定活性后种板培养;培养第3~4天加入阿糖胞苷纯化神经元;最后用甲苯胺蓝染色检测尼氏体进行鉴定。结果:实验获取细胞存活率高;在体外培养条件下细胞生长旺盛,培养第6~7天,细胞胞体较大,突起粗,分支多,突起交织成网,并能形成典型的神经细胞网络;培养第10~14天,检查有尼氏体细胞占90%以上。结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法。     

新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较为理想的小脑颗粒神经元原代培养方法。方法:取新生5~7天SD大鼠,分离小脑皮质,胰酶消化后差速贴壁,种植在预先涂有左旋多聚赖氨酸的培养板内,第3天加入阿糖胞苷纯化神经元;采用神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经元。结果:细胞存活率达(98±1.07)%;24 h内基本贴壁;第3天细胞突起增多、变长;培养6~8天,细胞突起交织成网,形成典型的神经细胞网络;神经元特异性烯醇化酶鉴定神经元细胞占90%左右。结论:实验获取神经元纯度较高,是小脑颗粒神经元体外培养的一种较理想的方法。     

MPTP对体外培养大鼠中脑多巴胺神经元毒性作用研究

本文研究１－甲基－４－苯基－１，２，３，６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）对体外培养大鼠中脑多巴胺（ＤＡ）神经元的毒性作用。取胚胎腹侧中脑，制成细胞悬液，常规体外培养。实验分为：正常对照组、高浓度ＭＰＴＰ（３０μｍｏｌ／ｍｌ）组、低浓度ＭＰＴＰ（３μｍｏｌ／ｍｌ）组和胆碱能神经元对照组。培养细胞定期抽出作免疫组化和荧光组化染色。高浓度ＭＰＴＰ组培养１０天，荧光组化阳性细胞已基本消失，此后酪氨酸羟化酶（ＴＨ）免疫反应的阳性细胞开始减少，至体外培养２周，每孔平均仅剩１４．５个，与正常对照组相比有显著性差异。残存的ＤＡ神经元突起缩短或消失。低浓度ＭＰＴＰ组培养２周后，大部分荧光组化阳性细胞消失，但对ＴＨ免疫反应阳性细胞的数量无明显影响。基底前脑胆碱能神经元体外生长不受ＭＰＴＰ干扰。实验结果提示ＭＰＴＰ对大鼠中脑ＤＡ神经元同样具有特异性损伤作用，其损伤程度与ＭＰＴＰ浓度有关。     

中脑腹侧多巴胺能神经元对氧化应激反应的性别差异

目的研究中脑腹侧(VM)多巴胺能神经元对氧化应激反应的性别差异。方法原代培养不同性别Balb/c胎鼠的VM多巴胺能神经元,分为对照组(未处理)、鱼藤酮组(25 nmol/L鱼藤酮处理8 h)、雌激素+鱼藤酮组(用1×10-7mol/L的17β-雌二醇预处理1 h后,加25 nmol/L鱼藤酮处理8 h)。采用免疫组织化学法观察不同性别神经元的损伤程度;MTT法检测细胞存活率;W estern b lotting检测不同性别细胞酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达。结果免疫组织化学检测结果显示:鱼藤酮组雄性细胞较雌性细胞损伤大,TH阳性细胞更明显。MTT检测结果显示:鱼藤酮组雄性细胞存活率为66%,雌性细胞存活率为75%,差异有统计学意义(P<0.05);雌激素+鱼藤酮组雄性细胞存活率为81%,雌性细胞存活率为86%,高于相同性别的鱼藤酮组(P<0.05)。W estern b lotting检测结果显示:鱼藤酮组雄性细胞的TH蛋白水平较雌性细胞明显下降(P<0.05);雌激素+鱼藤酮组TH蛋白水平高于相同性别的鱼藤酮组(P<0.05)。结论 VM多巴胺能神经元对氧化应激反应存在性别差异,雄性细胞对鱼藤酮的刺激较雌性...     

新生大鼠中脑黑质神经细胞的原代培养

对新生1天大鼠中脑黑质神经细胞进行原代培养，以建立稳定的神经细胞培养模型。通过光镜对培养各阶段的神经细胞系统地观察，描写了它们的生长发育过程和形态特征，同时用特异性诱发荧光技术和酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学方法，进一步确定培养的黑质神经细胞的化学性质。本方法与通常从胚胎鼠取材比较，具有难度小，取材范围大的优点。     

帕金森病大鼠中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的改北

目的：探讨帕金森病（PD）大鼠中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺（DA）能神经元的改变.方法：20只3月龄Wistar雄性大鼠,随机分为模型组和对照组,每组10只.6-羟基多巴胺（6-OHDA）注射右侧黑质致密区（SNC）制作PD大鼠模型,腹腔注射阿朴吗啡后进行行为学观察;尼氏染色观察左侧中脑VTA神经元、酪氨酸羟化酶（TH）的改变;免疫组织化学ABC法观察其DA能神经元的改变并进行图像分析.结果：阿朴吗啡诱发PD大鼠模型异常旋转行为,尼氏染色见PD大鼠左侧中脑VTA有神经细胞肿胀、坏死等变化;VTA TH阳性神经元形态学改变,数量减少,与对照组相比,差异有统计学意义.结论：中脑VTA DA能神经参与PD模型大鼠的改变.     

百草枯和氧桥氯甲桥萘对离体大鼠中脑多巴胺神经元的损害

目的建立大鼠中脑多巴胺神经元的培养体系,判断百草枯(Paraquat)和氧桥氯甲桥萘(Dieldrin)能否对培养的大鼠中脑多巴胺神经元产生选择性损害。方法将0.001～100μmol/L浓度的Paraquat、Dieldrin加入到原代培养的大鼠中脑多巴胺神经元中,计数存活的多巴胺神经元和非多巴胺神经元。结果Paraquat对大鼠中脑多巴胺神经元无选择性损害。1μmol/LDieldrin能选择性损害大鼠中脑多巴胺神经元。结论Dieldrin可能是致帕金森病(PD)的神经毒物,它与PD病因之间的联系值得进一步研究。     

Engrailed基因对中脑多巴胺能神经元发育的影响

神经系统在结构和功能上都是一个高度复杂的系统,发育生物学虽为生物学中重要的领域,近20年来因新技术的引进,使得发育研究进人基因层次,能更清楚地了解控制机制。中脑多巴胺（midbrain dopamine,mDA）能神经元是哺乳动物中枢神经系统多巴胺的主要来源,对中脑多巴胺神经元的发育过程及其调节机制的研究是神经发育生物学的重要问题,多巴胺神经元的发育是一包括多种转录因子和生长因子参与的严格控制过程。     

新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录

目的探讨一种适用于膜片钳全细胞记录的海马神经元培养方法。方法选择鼠龄在1d内的Wistar大鼠,迅速断头,取双侧海马,神经基础培养基添加B-27及L-谷氨酰胺进行神经元原代培养,培养至第10天时,使用免疫荧光技术配合神经元特异性核蛋白NeuN进行细胞鉴定;神经元的电生理特征由膜片钳全细胞记录。结果该方法所培养神经元状态良好,经鉴定发现纯度可高达100%,通过膜片钳全细胞法可记录到自发性动作电位及自发性兴奋性突触后电流。结论本方法操作简便、高效,所培养的海马神经元状态良好,适用于膜片钳全细胞记录。     

谷氨酸在体外对新生大鼠中脑腹侧神经元的神经毒性作用

目的 探讨谷氨酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）在体外对中脑腹侧神经元的神经毒性作用。方法 用培养的新生大鼠中脑侧神经元，暴露于谷氨酸后，经抗酪氨酸羟化酶（ＴＨ）和抗γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）双重免疫细胞染色，观察谷氨酸对神经元的毒性作用以及与其受体的关系，结果 新生大鼠中脑腹侧主要含有多巴胺（ＤＡ）及ＧＡＢＡ神经元，谷氨酸对体外培养１周的ＤＡ神经元的半数致死量为６０μｍｏｌ／Ｌ而对ＧＡＢＡ神经元的半数致死量     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法

目的：介绍一种简单、生长良好的大脑皮层神经元的培养方法。方法：急性分离新生鼠大脑皮层制作单细胞悬液进行原代培养,观察培养神经元的生长形态,并用免疫荧光化学法对其进行鉴定。结果：培养的神经元细胞清晰,光晕明显,生长良好,免疫荧光鉴定结果表明该方法培养的细胞纯度较高,能够达到实验研究的要求。结论：该培养方法简单、可靠,是神经元培养的良好方法。     

中脑腹侧被盖区多巴胺神经元在全身麻醉中的作用研究

目的 探讨中脑腹侧被盖区(VTA)多巴胺神经元在全身麻醉诱导和苏醒中的作用.方法 成年健康雄性SD大鼠40只,分为毁损组(n=20)和对照组(n=20),毁损组在双侧VTA给予特异性多巴胺神经元毁损药6-羟多巴胺(6-OHDA)减少多巴胺神经元,对照组在双侧中脑腹侧被盖区给予等量生理盐水.待手术后两周,观察在全身麻醉下,大鼠翻正反射消失时间(LORR)和恢复时间(RORR).结果 与对照组相比,在丙泊酚麻醉下可显著缩短大鼠LORR (P＜0.05),且明显延长大鼠RORR(P＜0.05).在异氟醚麻醉下毁损组与对照组相比,大鼠LORR,差异无统计学意义(P＞0.05),但大鼠RORR延长(P＜0.05).结论 VTA多巴胺神经元在不同的全身麻醉药的诱导和苏醒发挥着有不同作用.     

大鼠皮层神经元原代培养方法的改进

目的:建立一种简单、较理想的新生大鼠皮层神经元体外原代培养方法.方法:采用低浓度、短时间胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.结果:在体外培养条件下神经元结构特征明显,并能形成典型的神经元网络.结论:本方法适合普通实验室进行大鼠皮层神经元体外培养.     

成年与老年大鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元形态学研究

目的研究大鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元随年龄老化的形态学变化规律，探讨其退行性变的形态学依据。方法SD大鼠16只，雄性，分为成年组（4-5月龄）和老年组（≥18月龄）。取中脑黑质，常规制片，连续冠状切片，分别进行焦油紫染色和TH免疫组化染色，用图像分析仪分别对Nissl染色细胞、TH免疫组化染色阳性神经元进行计数，透射电镜观察神经元的超微结构变化。结果老年大鼠中脑黑质神经元数量减少（P〈0．05），TH阳性神经元也同时减少（P〈0．05），且在超微结构上老年大鼠多巴胺能神经元出现内质网扩张及多量脂褐素形成。结论老年黑质退行性病变可能与中脑黑质致密部多巴胺能神经元数量减少有关。     

NGF对大鼠离体中脑神经元存活和突起生长的影响

研究神经生长因子对中脑神经元的突起生长和促生存作用。方法采用体外培养法进行形态学观察与测量。每个视野的细胞数ＮＧＦ组较对照组明显增多，；ＮＧＦ组细胞突起个数多于对照组，Ｐ〈０．０５；但两组细胞突起长度却无明显差别。结论ＮＧＦ对大鼠离体中脑神经元的生长发育有明显的促进作用。     

谷氨酸对小鼠胚胎中脑原代细胞培养中多巴胺能神经元损伤的时程效应

目的：探讨谷氨酸兴奋性损伤诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤的时程效应,阐明谷氨酸兴奋性毒性在帕金森病(PD）模型中对多巴胺能神经元损伤的作用。方法：取孕14 d小鼠胚胎的中脑组织制备成细胞悬液,进行原代培养,分为对照组和谷氨酸用药组。细胞在体外培养第10天,加入500 μmol·L^-1谷氨酸并作用15 min,分别于用药后2、 4、 6、24 和48 h进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学染色。在显微镜下计数TH染色阳性神经元数量及每个神经元突起数量。结果：对照组中每个培养孔多巴胺能神经元的数量平均为（778.0±18.6）个,谷氨酸用药组2、4、6、24 和 48 h多巴胺能神经元数量平均为（306.0±8.6）、（314.0±15.4）、（298.0±19.1）、（307.0±18.5）及（323.0± 23.8）个。谷氨酸用药各组中多巴胺能神经元数量较对照组明显减少(P<0.05),但谷氨酸用药组2、4、6、24 和 48 h多巴胺能神经元数量比较差异无显著性(P>0.05)。随机选取每组100个多巴胺能神经元的突起进行计数,对照组多巴胺能神经元的突起数量平均为（3.440±0.106）个,谷氨酸用药组2、4、6、 24 和 48 h时多巴胺能神经元突起数量分别为（2.240±0.105）、（2.390±0.103）、（3.070±0.105）、（3.420±0.987）和 （3.420±0.923）个。谷氨酸用药后2和4 h多巴胺能神经元的突起数量较其他各组均明显减少(P<0.05)。结论: 谷氨酸可在体外诱导小鼠胚胎中脑原代培养中多巴胺能神经元的损伤和死亡,是一个相对急性、不可逆的损伤过程,但随着损伤后恢复时间的延长,损伤的多巴胺能神经元形态可恢复。     

大鼠脊髓神经元原代细胞的分散培养

目的　建立一种简单、易行、满足基本科研需要的脊髓神经元原代细胞分散培养法。方法　取Wistar大鼠胎鼠或新生鼠的脊髓 ,以胰蛋白酶消化和机械吹打相结合 ,将组织分散成细胞悬液 ,培养于含10 %胎牛血清和阿糖胞苷 (抑制胶质细胞的增殖 )DMEM培养基中 ,观察脊髓神经元细胞生长状况。结果　3～ 6h细胞开始贴壁 ,胞体周围渐有突起 ;2～ 3d胞体明显增大 ,突起生长旺盛 ,连接呈网络 ;10d时细胞形态最为丰满 ;3周后细胞开始退化 ,胞内出现空泡。结论　培养的脊髓神经元形态发育符合正常规律变化 ,适用于形态学、生化、遗传、药理等学科研究     

痴呆模型大鼠中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的形态学改变

目的观察铝中毒痴呆模型大鼠中脑腹侧被盖区(VTA)多巴胺(DA)神经元的形态学变化,探讨中枢多巴胺递质在学习、记忆中的作用.方法以慢性铝中毒方式建立痴呆模型,以酪氨酸羟化酶(TH)为DA神经元的阳性标记物,采取免疫细胞化学ABC法观察中脑VTA TH免疫反应阳性神经元的形态学改变,利用图像分析系统测算VTA TH免疫反应阳性神经元的数目,分析试验结果.结果痴呆模型组中脑VTA TH免疫反应阳性神经元数量明显下降(P＜0.01),部分神经元出现突起消失、胞体肿胀或碎裂等表现.结论中脑VTA DA神经元与认知功能关系密切,其病变可能同老年性痴呆有关.     

Citicoline对大鼠中脑原代细胞培养的神经保护作用

目的：探讨胞二磷胆碱（citicoline,CC）对6-OHDA诱导的帕金森体外细胞模型的保护作用及其机理。方法：孕15 d大鼠胚胎中脑原代培养,在培养第6 、8及10天,实验组加不同浓度CC（2、1、0.1、0.01和0.001 mmol·L^-1 ）,并于第11天加50 μmol·L^-1的6-OHDA作用0.5 h,制作帕金森病细胞模型;6-OHDA组为原代培养细胞加50 μmol·L^-1的6-OHDA;对照组为原代培养细胞。培养11 d收集细胞。采用MTT法测细胞活力,通过流式细胞仪,用Fluo3/AM检测细胞内Ca²⁺i及用罗丹明123检测线粒体膜电位（Δψm）。结果：2、1和0.1 mmol·L^-1 CC组,细胞活力与对照组比较明显增高,并随着浓度的增加而增加,差异具有显著性(P<0.05)。1、0.1、0.01 和0.001 mmol·L^-1 CC+6-OHDA组,细胞活力均高于6-OHDA组,差异有显著性（P<0.01）。1、0.1、0.01、0.001 mmol·L^-1 CC+6-OHDA组细胞内Ca²⁺i均明显下降,分别为(32.23±1.87)%、(17.09±7.45)%、(21.71±8.89)%及(29.18±4.71)%,与6-OHDA组（49.30±7.62）%相比,差异均有显著性（P<0.01）;与对照组（42.40±0.81）%比较明显下降,差异均有显著性（P<0.01）。CC+6-OHDA各组与6-OHDA组比较均使Δψm升高,其中1 mmol·L^-1CC+6-OHDA组Δψm高于对照组,差异有显著性（P<0.01）。结论：CC通过保护神经元细胞膜、增加细胞活力、降低细胞内Ca²⁺i以及提高Δψm,发挥其对神经元的保护作用。