脱细胞牛心包种植人血管混合细胞构建组织工程心脏瓣膜

目的 探讨在脱细胞牛心包上种植人血管混合细胞构建组织工程心脏瓣膜的方法与效果.方法 将体外培养的人血管混合细胞种植在脱细胞牛心包材料上,观察种子细胞形态学和免疫组织化学变化和牛心包超微结构变化,并测定内皮细胞分泌t-PA和PAI-1的活性.结果 种子细胞全层覆盖脱细胞牛心包表面,并浸润至组织内部生长;牛心包表面为扁平、片状、分层的细胞覆盖,细胞表面有少量绒毛和纤细的纤维结构.免疫组化显示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白、成纤细胞Fibronectin相关抗原呈阳性表达;种子细胞能分泌纤溶活性物质t-PA和PAI-1.结论 人血管混合细胞种植后附着满意,与脱细胞牛心包生物相容性好,生长状况好,并具有内皮功能.     

脱细胞牛心包膜材料与胶原膜引导骨再生的对照研究

目的 比较碳化二亚胺[1-ethyl-3（3-diaminopropyol）-carbodiimide，EDAC]交联脱细胞牛心包（acellular bovine pericardium，ABP）与胶原膜引导骨再生的作用和膜材料植入动物体内的转归。方法 健康雄性成年新西兰白兔24只，体重2．6～3．5kg，平均3．1kg。制备兔双侧下颌体7mm×7mm×5mm骨缺损模型，一侧骨缺损覆盖EDAC交联ABP（EDAC交联ABP组），另一侧覆盖胶原膜（胶原膜组）。术后4、8、16及24周各处死6只动物行大体、组织学观察及图像分析检测新生骨面积百分比及膜材料吸收替代百分比。结果 大体观察：术后4、8周EDAC交联ABP组膜材料完整，与缺损区正常骨粘连紧密；胶原膜组膜材料形态消失，骨缺损区轮廓欠清晰。术后16、24周EDAC交联ABP组骨缺损区创面平坦；而胶原膜组凹凸不平。组织学观察：术后4、8周EDAC交联ABP组胶原纤维排列规则，缺损区中央大量新生骨小梁；胶原膜组胶原纤维断裂，缺损区见大量新生骨小梁。术后16、24周，EDAc交联ABP组骨缺损区形成完整的骨桥，而胶原膜组骨缺损内局部长入纤维结缔组织。术后4、8周，两组新生骨面积百分比相近，16周EDAC交联ABP组为81．99％±3．92％，胶原膜组为76．35％±4．29％，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。术后4、8、16及24周，EDAC交联ABP组膜材料平均吸收替代百分比分别为16．57％、27．94％、65．61％和85．72％；胶原膜组4周降解超过50％，8周已完全降解吸收。结论 EDAC交联脱细胞牛心包膜材料引导成骨的效率优于胶原膜。     

肺减容手术用国产牛心包垫片的研制

目的：研制开发肺减容手术用可替代昂贵进口产品的国产牛心包垫片，并初步验证其应用的可行性。方法精选2～3岁鲁西南牛或秦川牛之心包，经特殊处理加工后制成3种不同厚度并呈“鞘状”的肺减容手术用牛心包垫片(A1、A2、A3)。利用犬模型对其进行评判和筛选，选取操作性能(包括钉合、切割及装卸3方面)及切缘耐压作为评判指标。结果：3种型别的产品多数功能指标满足要求，其中A3组产品最适合临床使用。结论：肺减容手术用国产牛心包垫片在动物实验中显示了良好的性能，具有推广临床试用的价值。     

脱细胞处理对戊二醛固定牛心包的影响

目前国内生物瓣膜使用有增多趋势,但生物瓣膜的耐久性仍影响其应用.再次换瓣的病理显示,损坏瓣膜大多都有明显钙化.一些实验证明,生物瓣膜的钙化首先是从细胞开始,然后向胶原纤维和弹力纤维蔓延.戊二醛固定引起细胞变化是导致生物瓣膜钙化的主要原因之一.所以,我们试图通过脱去牛心包内细胞的方法减轻戊二醛固定牛心包的钙化.     

脱细胞牛心包羊肺动脉补片的实验研究

目的　评价脱细胞牛心包构建有活性的组织工程羊肺动脉补片的可行性。　方法　将新鲜牛心包采用酶 -去污剂联合脱细胞处理作为血管补片材料 ,从小尾寒羊颈外静脉分离血管内皮细胞和成肌纤维细胞进行传代扩增培养 ,然后分层种植到已消毒的脱细胞牛心包 ,体外培养 7d后 ,自体细胞 -脱细胞牛心包补片作为实验组 (n=5 )植入羊肺动脉 ,分别于 4周 ,6周 ,8周 ,12周和 2 4周取材 ;单纯脱细胞牛心包补片作为对照组 (n=3) ,于 4周 ,12周和 2 4周取材 ,对两组牛心包补片均进行大体观察和组织学检查 ;测定钙、胶原和弹性蛋白的含量。　结果　所有动物均存活 ,羊肺动脉补片内未见血栓 ,无明显动脉瘤样扩张 ,两组补片钙含量与正常肺动脉比较无明显差别。随补片植入时间的推移 ,弹性蛋白含量逐渐增加 ,与正常肺动脉弹性蛋白含量相似 ,显示进行性的组织重塑。　结论　自体细胞 -脱细胞牛心包羊肺动脉补片与单纯脱细胞牛心包补片在体内通过组织重塑在一定程度上均可形成有活性的血管壁组织。     

羟基铬减缓生物瓣钙化的实验研究：Ⅲ.羟基铬改性牛心包…

观察羟基铬改性牛心包瓣片以血管架桥的方式植入犬循环系，在与血液直接接触并在一定压力的情况下的抗钙化作用。经植入４个月后的组织试片形态学观察和原子吸收法组织钙含量测定，结果发现ＨＣ改性的组织瓣片在犬循环系植入４个月的模型中仍具有较好的抗钙化作用。     

脱细胞羊膜的制备及其生物相容性研究

目的制备脱细胞人羊膜(HAAM),检测其细胞相容性和组织相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性. 方法新鲜人羊膜经漂洗后戊二醛交联,0.5%SDS震摇24小时,胰蛋白酶消化4小时,充分漂洗,冷冻干燥,分装,环氧乙烷消毒备用.倒置相差显微镜和扫描电镜观察表面结构,测量孔径,并作HE、Mallory染色.体外培养人成纤维细胞并复合于HAAM,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附、生长,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定HAAM浸提液对培养的人成纤维细胞的细胞毒性.将HAAM植入SD大鼠背部皮下,观察其组织相容性. 结果 HAAM的一面为网状结构,孔径为10～80 nm,另一面为致密纤维结构.HE、Mallory染色表明材料无细胞残留,均为胶原组成.成纤维细胞能在HAAM上黏附、增殖.MTT示材料细胞毒性为0或1级,动物埋置实验无异常反应. 结论应用去垢剂-酶消化法处理新鲜人羊膜,能有效去除组织中的细胞和可溶性成分,可进一步降低其免疫原性,保留基质及网状结构,有良好的细胞相容性和组织相容性,可作为组织缺损的修复材料及组织工程的膜支架材料.     

新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据.[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架.分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验.采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化.[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7d后各时间段内三组OD值两两比较(P＞0.05)无显著差异,表明材料无毒性.在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0％,在标准值溶血率5％范围内,提示无溶血现象发生.热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用.[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料.     

异种脱细胞真皮基质作为软组织填充物的生物相容性研究

目的 探讨异种脱细胞真皮基质(Xeno-ADM)作为软组织填充物植入大鼠体内的生物相容性,为临床软组织缺损凹陷修复提供参考依据.方法 72只SD大鼠随机分为3组:异种组、异体组和自体对照组.分别将Xeno-ADM、异体脱细胞真皮基质和自体真皮植入各组大鼠背部皮下.术后2～32周,根据病理组织学和形态学变化,评估Xeno-ADM的生物相容性.结果 移植早期(<16周),异种组移植物炎性反应程度较异体组强烈,外周包膜厚度较异体组更厚,血管化程度低于异体组.16～32周,异种组与异体组炎性反应无明显区别,外周包膜形成不明显.结论 Xeno-ADM具有良好的生物相容性,适合作为一种生物软组织填充材料.     

改良消蚀法制备脱细胞真皮基质微粒及其生物相容性评价

目的:利用改良消蚀法制备一种新型脱细胞真皮基质(Acellular dermal matrix,ADM)微粒,并对其相容性加以评价,为组织工程微粒皮肤的制备奠定研究基础。方法:应用机械法切除猪真皮乳头层,结合消蚀法和冻融法除去网状真皮中的所有细胞制备成ADM,将ADM搅碎成颗粒状,对其做细胞毒性实验和皮下埋藏实验检验其相容性。结果:该方法制备的ADM微粒韧性好,细胞去除完全,胶原三维稍松散但结构完整,无基底膜和乳头层。细胞毒性实验显示其基本无毒性,成纤维细胞在ADM微粒上增殖良好,皮下埋藏试验未见明显排异反应,ADM微粒能诱导血管和成纤维细胞长入。结论:用改良消蚀法制备的ADM微粒抗原性低、相容性好,可以作为组织工程微粒皮肤的支架和填充材料。     

自体骨髓促进引导性骨再生

目的　研究自体骨髓增强引导性骨再生 (GBR)修复骨缺损的能力。方法　 18只兔分为 5组 ,每组 3只 (第 5组 6只 ) ,造成双桡骨干 10 mm骨缺损 ,以硅胶管桥接骨断端 ,实验组于 0、2和 4周分别在硅胶管内注射自体骨髓 0 .3ml;对照组于相同时间点注射等量外周静脉血。在不同时间内作 X线片、大体、组织学观察及生化检测。结果　实验组成骨活跃 ,10周骨缺损完全修复 ,对照组各时间点均较实验组差 ,10周时仍无 1只兔骨性愈合。术后 2、4周实验组钙及碱性磷酸酶含量明显高于对照组。结论　自体骨髓可明显增强 GBR修复骨缺损的能力     

酸性成纤维细胞生长因子促进引导性骨再生的实验研究

目的　研究酸性成纤维细胞生长因子（α Ｆ Ｇ Ｆ）对引导性骨再生（ Ｇ Ｂ Ｒ）的作用,增强 Ｇ Ｂ Ｒ 修复骨缺损的能力。方法　１６ 只新西兰白兔分为四组,每组 ４ 只,造成兔双侧桡骨干１０ ｍ ｍ 节段性骨缺损,以硅胶管桥接骨缺损,实验侧管内置入人基因重组酸性成纤维细胞生长因子（ｈｒａ Ｆ Ｇ Ｆ）２４ μｇ,对侧管内注入生理盐水作对照。于术后２、４、６ 及８ 周各处死一组兔,作 Ｘ 线、大体、组织学观察。结果　实验侧术后２ 周即在骨断端髓腔、骨内膜及皮质断面处有新骨形成,并长入管内血肿,术后４ 周新骨长入血肿中心,８ 周完全骨愈合。对照侧在各阶段新骨形成均不如实验侧,８ 周时仅出现部分骨愈合。结论　酸性成纤维细胞生长因子（ａ Ｆ Ｇ Ｆ）可促进 Ｇ Ｂ Ｒ,增强其修复骨缺损的能力。     

无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的研究

目的　研究用无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的效果及组织学变化。方法　将 4 2只裸鼠分为实验组及对照组 ,实验组于背部全层皮肤缺损创面移植无细胞异种真皮及人表皮细胞悬液 ,对照组单纯移植人表皮细胞悬液。于术后 2、3和 5周计算创面愈合率 ,术后 3、6和 12周计算创面收缩率 ,并取活检行组织学检测。结果　实验组创面愈合率高 ,分别为 79.1%± 4 .5 % ,89.6 %± 4 .4 % ,98.1%± 3.4 % ,收缩程度轻为 16 .3%± 5 .2 % ,2 5 .5 %±7.2 % ,32 .5 %± 7.1% ,外观平整 ,质地良好 ,胶原纤维排列整齐 ,基底细胞桥粒 -半桥粒结构及基底膜等结构重建明显 ,未见明显的急性排斥反应 ;对照组创面愈合率分别为 6 9.2 %± 4 .9% ,78.2 %± 7.6 % ,90 .6 %± 5 .0 % ,收缩率为2 0 .5 %± 6 .0 % ,31.3%± 6 .9% ,4 4 .6 %± 7.2 % ,与实验组相比 ,均有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,愈合后的表皮质地薄 ,易破溃 ,胶原纤维紊乱 ,表皮 -真皮连接结构重建不明显。结论　无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植修复创面 ,可改善创面愈合质量。     

快速培养纯化猪角朊细胞及复合羊膜体外培养实验研究

目的研究快速培养和纯化猪角朊细胞的方法及观察角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况,为组织工程皮肤研究提供实验依据.方法采用加10%胎牛血清的人无血清角朊细胞培养基(defined keratinocyte-SFM,DKSFM)培养原代猪角朊细胞,分别用DKSFM(A组)、加5%胎牛血清的DKSFM(B组)、加10%胎牛血清的DKSFM(C组)培养传代猪角朊细胞,于接种后1、3、5和7 d观察猪角朊细胞的形态及生长曲线.利用猪角朊细胞与培养瓶黏附牢固的特点,用0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和0.05%胰蛋白酶分步消化,纯化细胞.将第2代猪角朊细胞接种在冻干脱细胞羊膜上,直接苏木素染色、石蜡切片、免疫组织化学染色等方法观察猪角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况.结果采用加10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,细胞生长速度快,形态好,培养5 d铺满培养瓶底60%～70%.B组培养的传代猪角朊细胞生长速度较C组培养猪角朊细胞生长速度快.A组培养传代的角朊细胞,细胞生长缓慢.用0.02?TA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可获得纯度为95%以上的猪角朊细胞.将第2代猪角朊细胞接种在脱细胞羊膜后12 d,可形成单层细胞,呈多角形、铺路石样排列;14 d和16 d细胞进一步密集,16 d细胞出现老化.结论 10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,5%胎牛血清的DKSFM培养传代猪角朊细胞,细胞生长速度快.用0.02?TA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可以获得高纯度猪角朊细胞.脱细胞羊膜为猪角朊细胞提供良好的支架,接种培养后12 d,细胞形态最好.     

脱细胞羊膜与脱细胞小肠黏膜下层修复猪创伤性皮肤缺损的比较研究

目的 比较脱细胞羊膜与脱细胞小肠黏膜下层作为创伤性皮肤缺损覆盖物,对创面修复的效果。方法 7只四川长白小猪,每只猪背部两侧各做3个4 cm×4 cm大小的皮肤缺损,深达深筋膜。每侧缺损随机分为3组,用不同敷料覆盖。A组：双层脱细胞羊膜；B组：双层脱细胞小肠黏膜下层；C组：空白,生理盐水纱布覆盖。术后观察创面局部情况、创面愈合率,10 d(2只,各组4个皮肤缺损)、20 d(2只,各组4个皮肤缺损)、30 d(3只,各组6个皮肤缺损)处死动物取材。行组织学观查,炎性细胞、血管内皮细胞及增殖细胞计数,羟脯氨酸含量测定。 结果A、B组覆盖的敷料与创面黏附紧密,与纱布无粘连,更换敷料时创面无渗血。C组纱布与创面黏附紧密,术后22 d前更换纱布时创面出血。组织学观察：术后各时间点A、B组皮下组织内炎性细胞数较C组少；C组皮下组织内胶原分布较A、B组紊乱。术后各时间点A、B组创面愈合较C组高,差异有统计学意义(P<0．05)；C组术后各时间点炎性细胞计数、皮下组织及肉芽组织内增殖细胞数明显高于A、B组,术后20、30 d,羟脯氨酸含量高于A、B组,差异有统计学意义(P<0．05)；3组内皮细胞计数,差异无统计学意义(P>0．05)。A、B组创面局部情况、创面愈合率、病理组织学检查、炎性细胞数计数、血管内皮细胞计数、增殖细胞计数和羟脯氨酸含量,差异均无统计学意义(P>0．05)。 结论 采用脱细胞羊膜、脱细胞小肠黏膜覆盖创伤性皮肤缺损,有提高创面愈合率、减少炎性反应,控制皮下组织及肉芽组织中细胞增殖,使胶原纤维有序排列的作用,能减少创面组织的出血和渗出。脱细胞小肠黏膜覆盖创面具有与脱细胞羊膜覆盖创面相近的修复效果。     

可降解聚己内酯修复骨缺损的实验研究

目的探讨聚己内酯(polycaprolactone,PCL)修复骨缺损的能力,为组织工程骨支架材料的可行性提供依据。方法新西兰大白兔65只,双侧股骨髁制成4.5mm×12mm的骨缺损动物模型。将PCL圆柱体植入到右侧骨缺损为实验组(n=60),羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)植入左侧骨缺损为对照组(n=60),空白组不植入任何物质(n=5)。于术后3、6、9和12个月将实验组及对照组取材进行大体观察、X线摄片、骨密度测定、99mTc-MDP扫描γ-显像比值测定及扫描电镜观察。空白组于术后12个月取材行大体观察。结果术后各时间点大体标本及X线片检查显示:实验组随着PCL材料的降解,骨缺损逐步被增生的骨质填充,无迟发性炎性反应出现;对照组无骨组织形成,为结缔组织充填;空白组大体观察缺损区未发现骨组织形成。骨密度测定表明:实验组骨密度增加,在各时间点与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。99mTc-MDP扫描γ-显像显示:实验组比对照组有更多的放射性核素聚集。扫描电镜观察:术后12个月,实验组随着PCL材料的逐步降解,PCL纤维移行处界面形成较多的密质骨样组织;对照组HA-组织之间可见较多的排列不规则的胶原纤维包绕。结论PCL材料具有良好的生物相容性、缓慢降解和骨引导能力,可修复骨缺损。     

膜引导性骨组织再生的实验研究

目的证实膜引导性组织再生现象存在于骨缺损的愈合过程中，并探讨其机理。方法采用新西兰大白兔为实验对象，将兔桡骨制成１ｃｍ缺损，一侧用羟基磷灰石／聚乳酸膜（ＨＡ／ＰＬＡ）包绕缺损，另一侧作为对照，通过Ｘ线片、大体观察及病理检查等观察两侧桡骨愈合情况。结果对照侧均呈现骨不愈合现象，实验侧有不同程度的骨愈合现象。结论膜技术的应用有利于骨缺损的愈合。     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。