血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞产生一氧化氮和三磷酸肌醇活性的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞产生一氧化氮(NO)、超氧阴离子(O2-)、三磷酸肌醇(IP3)活性的影响。方法不同浓度的AngⅡ和胰岛素加入体外培养的人脐动脉平滑肌细胞,分别测定细胞培养液中一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,NO、环鸟苷酸(cGMP)和O2-浓度,3H标记肌醇-逐步洗脱法测定IP3活性。结果胰岛素(10、100、1000mU/L)使平滑肌细胞NOS活性升高,NO、cGMP产生增加,对SOD活性和O2-水平无影响,对IP3活性无明显影响;0.1、0.5nmol/LAngⅡ对NOS活性、NO和cGMP产生无明显影响,1nmol/LAngⅡ使NOS活性下降(P<0.05),NO、cGMP产生减少(P<0.05或<0.01),0.1、0.5、1nmol/LAngⅡ使SOD活性下降(P<0.05或<0.01),O2-水平升高(P<0.01),使IP3活性升高(P<0.05);胰岛素10mU/L AngⅡ0.1nmol/L、胰岛素100mU/L AngⅡ0.5nmol/L、胰岛素1000mU/L AngⅡ1nmol/L使NOS活性下降(P<0.01),NO和cGMP产生减少(P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),O2-水平升高(P<0.01),使IP3活性升高(P<0.05);0.1nmol/LAngⅡ 1μmol/L氯沙坦、0.5nmol/LAngⅡ 5μmol/L氯沙坦、1nmol/LAngⅡ 10μmol/L氯沙坦可以改善AngⅡ引起的NOS、SOD活性下降,NO、cGMP产生减少,O2-水平升高,以及AngⅡ引起的IP3活性升高,但与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论胰岛素使平滑肌细胞NO产生增加,对IP3活性无影响。高浓度AngⅡ使NO产生减少,O2-水平升高,使IP3,活性升高,可以被氯沙坦阻断,胰岛素和AngⅡ同时存在时平滑肌细胞NO产生减少,O2-水平升高,可以使IP3活性升高。     

胰岛素对平滑肌细胞产生一氧化氮的影响

目的：探讨胰岛素和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对人脐动脉平滑肌细胞产生一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O^-2）的影响.方法：不同浓度的AngⅡ和胰岛素加入体外培养的人脐动脉平滑肌细胞,分别测定细胞培养液中一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）活性,NO、环鸟苷磷酸（cGMP）和O^-2浓度.结果：胰岛素（10,100,1 000mU/L）使平滑肌细胞NOS活性升高,NO、cGMP产生增加,对SOD活性和O^-2无影响;1.0 nmol/LAngⅡ使NOS活性下降,NO、cGMP产生减少;0.1,0.5,1.0 nmol/L AngⅡ使SOD活性下降,O^-2水平升高;胰岛素和AngⅡ同时存在时NOS活性下降,NO和cGMP产生减少,SOD活性下降,O^-2水平升高;氯沙坦（losartan）可以改善AngⅡ引起的NOS、SOD活性下降,NO、cGMP产生减少,O^-2水平升高.结论：胰岛素使平滑肌细胞NO产生增加,高浓度AngⅡ使NO产生减少,O^-2水平升高,且可以被Losartan阻断,胰岛素和AngⅡ同时存在时平滑肌细胞NO产生减少,O^-2水平升高.     

不同浓度葡萄糖和胰岛素对血管内皮细胞形态学影响

为了解不同浓度葡萄糖和胰岛素对血管内皮细胞形态学的影响 ,将人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4在六种葡萄糖浓度(为 5 .0 mmol/ L、10 mmol/ L、2 0 mmol/ L、2 5 mmol/ L、30 mmol/ L和 35 mmol/ L )和四种胰岛素浓度 (为 0μU/ ml、2 0μU/ ml、30μU/ ml和40μUml)下培养 2 4小时、48小时、6天 ,免疫荧光及 HE染色观察其形态学变化。结果显示 ,内皮细胞凋亡数随葡萄糖浓度升高而明显增多 ,并出现巨大细胞及多核细胞 ;胰岛素有促进内皮细胞增殖作用     

胰升糖素样肽-1对胰岛β细胞胰岛素基因表达的调节作用

目的 研究不同浓度胰升糖素样肽-1（GLP-1）对大鼠胰岛β细胞胰岛素基因表达的影响,探讨GLP-1在2型糖尿病治疗中的作用。方法 不同刺激浓度的GLP-1（0nmol／L、1nmol／L、10nmol／L、10^2nmol／L、10^3nmol／L）与葡萄糖浓度分别为2．2mmol／L、5．5mmol／L、11.1mmol／L的RPMI1640营养液共培养24h后,提取细胞总RNA,运用半定量RT-PCR技术检测胰岛素基因表达的变化。结果 葡萄糖浓度为2．2mmol／L和5．5mmol／L时,随GLP-1浓度升高,胰岛素基因表达量呈钟型方式升高;葡萄糖浓度为11．1mmol／L时,随GLP-1浓度升高,胰岛素基因表达量呈浓度依赖性升高。结论 GLP-1以葡萄糖依赖和浓度依赖方式促进胰岛素基因的表达。     

软脂酸诱导HepG2细胞胰岛素抵抗及其机理

目的 研究游离脂肪酸（FFA）诱导人肝癌细胞（HepG2）产生胰岛素抵抗及其分子机理。方法 用含0．25mmol／L的软脂酸（软脂酸组）或100nmol／L胰岛素（高胰岛素组）的DMEM培养基培养HepG2细胞,再用100nmol／L胰岛素刺激后,测定其培养液中的葡萄糖浓度、细胞内的糖原含量以及胰岛素受体底物2（IRS-2）的蛋白水甲。加入磷酯酰肌醇3激酶（P13K）的抑制剂wortmannin,再次检测IRS-2的蛋白水平。结果 软脂酸组和高胰岛素组培养液中葡萄糖含量明显高于正常对照组（P＜0．05）,而细胞内糖原含量显著减少（P〈0．01）。软脂酸组胰岛素刺激的IRS2蛋白水平显著低于正常对照组（P〈0．01）。用wortmannin处理后,软脂酸组中的IR导2蛋白水平差异无显著意义（P〉0．05）,而正常细胞组中IRS-2蛋白水平差异有显著意义（P〈0．01）。结论 0．25mmol／L的软脂酸培养24h后,HepG2细胞可产生胰岛素抵抗,且胰岛素信号转导途径存在障碍;P13K是胰岛素信号转导途径中的关键调节点,可能IRS-2和一些P13K相关分子缺陷与游离脂肪酸诱导的肝胰岛素抵抗的形成有关。     

蒺藜皂苷对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察蒺藜皂苷（GSTT）对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及相关因素的影响。方法采用培养的牛VSMC，以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）为刺激因子，应用MTT法检测细胞增殖；以H2O2为刺激因子，应用激光扫描共聚焦显微镜检测VSMC内钙离子浓度；应用硝酸还原酶法检测培养的牛血管内皮细胞NO释放量。结果GSTT能明显抑制AngⅡ刺激的VSMC增殖，具有剂量依赖性；GSTT也能抑制H2O2所致的VSMC内钙离子浓度升高，使血管内皮细胞释放的NO明显增多。结论GSTT能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖，此作用可能与抑制活性氧激活钙离子信号转导途径、增加血管内皮细胞NO含量等因素有关。     

血脂康对血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞E-选择素表达的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对人脐静脉内皮细胞（简称内皮细胞）E-选择素表达的影响以及血脂康对AngⅡ此诱导作用的干预。方法用ELISA法检测AngⅡ对内皮细胞E-选择素表达的影响，用RT—PCR检测AngⅡ对内皮细胞E-选择素mRNA表达的影响，用细胞计数法观察经AngⅡ作用的内皮细胞与单核细胞的粘附率，同时检测血脂康的干预效应。结果四种不同浓度的AngⅡ（10^-8、10^-8、10^-7、10^-6mol／L）能诱导内皮细胞E-选择素及其mRNA的表达，增加内皮细胞与单核细胞的粘附率，且作用呈剂量依赖关系；而血脂康（500ng／ml）能抑制AngⅡ诱导的内皮细胞E-选择素及其mRNA的表达，降低内皮细胞与单核细胞的粘附率。结论血脂康能发挥抗动脉粥样硬化作用，抑制动脉粥样硬化的进程。     

淫羊藿苷对血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

探讨淫羊藿苷对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导损伤人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）的影响。培养内皮细胞，淫羊藿苷作用24h后，采用AngII诱导制备内皮细胞损伤模型，测定细胞存活率（MTT法）、培养液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量、NO值、清除超氧阴离子自由基（O2^-）和羟自由基（·OH）的能力，测定胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、T-NOS、iNOS以及eNOS的含量。与AngⅡ单独处理组相比，淫羊藿苷能明显提高细胞存活率，提高SOD、T-NOS和cNOS活力，提高NO含量，增强清除O2^-和·OH的能力，降低LDH和iNOS的量。结果表明淫羊藿苷对AngⅡ损伤的内皮细胞有一定的保护作用。     

葡萄糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响

目的：目前小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESC）常规应用高浓度葡萄糖（25mmol／L）培养基培养,但是在应用干细胞向糖尿病胰岛beta细胞分化的研究中发现,慢性高糖培养可促进干细胞的凋亡、降低细胞分化的效率及分化后胰岛beta细胞对葡萄糖的反应性,因此本研究拟选择合适的较低浓度的葡萄糖以优化胚胎干细胞的培养基、提高胚胎干细胞的生长、分化效率。方法：mESC传代4或12h后,将传统的25mmol／L葡萄糖培养基分别换为5、10、15、25mmol／L葡萄糖培养基培养,均用碱性磷酸酶（AP）染色计数细胞集落形成情况、台盼兰染色测定细胞数目,MTT法测定细胞活力及用4’,6-联脒-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色检测细胞凋亡情况。结果：mESC传代4h后即调换葡萄糖浓度：（1）各葡萄糖浓度组（5、10、15mmol／L）与25mmol／L组相比,集落形成明显减少。（2）各葡萄糖浓度组与25mmol／L组相比,mESC增殖及细胞活力均受到不同程度明显影响。mESC传代12h后调换葡萄糖浓度：（1）各葡萄糖浓度组（5、10、15mmol／L）与25mmol／L组相比,集落形成无明显变化,且AP染色呈强阳性。（2）15mmol／L葡萄糖组对mESC增殖及细胞活力均无明显影响。（3）15mmol／L葡萄糖组与25mmol／L葡萄糖组细胞核形态正常,均未见明显凋亡。结论：ESC传代12h后将培养基中传统的高糖（25mmol／L）降低为15mmol／L,不影响mESC细胞活力及多能分化潜能和未分化状态。     

高糖对体外培养的人脐静脉内皮细胞中c-fos的影响研究

目的观察高糖作用人脐静脉内皮细胞时c—fos基因mRNA和蛋白的表达的变化。方法提取并体外培养人脐静脉内皮细胞,分别加入不同浓度葡萄糖（5．5mmol/L、11mmol/L、22mmol/L、44mmol/L）并分别作用不同时间,应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测c—fos基因mRNA的表达,免疫细胞化学检测c—fos蛋白表达。结果经高糖处理的人脐静脉内皮细胞中,c—fos基因mRNA的转录水平明显高于对照组（P〈0．05或P〈0．01）。但是脐静脉内皮细胞经22mmol/L葡萄糖作用1h,c—fos基因的mRNA水平不再升高,而呈下降趋势（P〈0．05）。经22mmol/L葡萄糖作用2h后,c—fns蛋白表达达到最高峰。结论高糖能引起脐静脉内皮细胞c—fosmRNA和蛋白表达增高。     

High Throughput Prediction Approach for Monoclonal Antibody Aggregation at High Concentration

Purpose

Characterization of the monoclonal antibody aggregation process and identification of stability factors that could be used as indicators of aggregation propensity with an emphasis on a large number of samples and low protein material consumption.

Methods

Differential scanning calorimetry, dynamic light scattering and size exclusion chromatography were used as the main methodological approaches. Conformational stability, colloidal stability and aggregation kinetics were assessed for two different IgG monoclonal antibody (mAbs) subclasses. Aggregation was induced by exposing the mAbs to 55°C for 3 weeks. mAb samples were prepared in different formulations and concentrations from 1 mg/mL to 50 mg/mL.

Results

High temperature stress of mAb samples revealed that monoclonal antibodies followed first order aggregation kinetics, which suggests that the rate-limiting step of monomer loss was unimolecular. Conformational stability of mAbs was estimated with denaturation temperature measurements. Colloidal stability was assessed with dynamic interaction parameter k _D . The correlation between aggregation kinetics and colloidal and conformational stability factors was evaluated and the dynamic interaction parameter was found to be a promising predictor of aggregation propensity of monoclonal antibodies. The meaning of using an intermolecular interaction parameter for prediction of what is essentially a unimolecular process is also discussed.

Conclusions

This work estimates the significance of different predictors of aggregation propensity at high concentrations as a part of a high throughput, low resource screening method and is a contribution towards determining protein aggregation phenomena in actual systems used for the development and production of biopharmaceuticals.

     

表达重组人红细胞生成素细胞株的高密度、高表达培养

用生物反应器培养能表达重组人红细胞生成素的工程细胞,使其达到高密度高表达。方法：先将工程细胞在含有５％胎牛血清的 ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养基中培养,待细胞总数达到 ２×１０~８个以上时,接种到５ Ｌ生物反应器中。用含有血清的培养基培养 ７ｄ后转为无血清ＣＨＯ专用培养基,继续培养 ３０ ｄ。在整个培养过程中,采用流加的方式连续培养,根据情况随时测定培养基中葡萄糖浓度,使其保持高于０．５ｇ／Ｌ,同时监测氨及乳酸盐浓度,避免浓度过高。每日采样测定收获液中红细胞生成素含量与活性,培养结束后,以０．２５％胰酶消化载体,待细胞全部脱落后计数细胞总量。 结果：细胞密度达 ６×１０~６个／ｍｌ培养液,表达量约 ３０ ０００ ＩＵ／ｍｌ左右,且表达的红细胞生成素具有较高的生物比活性。结论：在较为适当的培养条件下,利用生物反应器可使工程细胞的培养达到高密度、高表达。