不同载体上人体脱落细胞富集方法的比较

目的 对不同载体上人体脱落细胞的富集方法进行比较研究.方法 选取使用过的口罩、衣服、手套, 分别采取负压吸附、粘取、剪取和擦拭4种方法富集脱落细胞.用QIAGEN QIAamp DNA Investigator Kit提取DNA, 用AB Identifiler系统进行PCR扩增, 用AB 3130 XL自动遗传分析仪进行扩增产物的电泳分离, 用Genemapper ID v3.2软件进行STR分型.结果 口罩、手套类体积小的载体, 采取负压吸附、粘取、剪取、擦拭的方法, 均能得到完整的STR分型图谱;而对于大件的衣服载体, 采用负压吸附和直接剪取明显斑迹处可得到完整的STR分型图谱.结论 对于纺织类渗透性载体, 体积较大时可采用负压吸附法富集人体脱落细胞;对于有明显斑迹的, 可直接剪取可疑斑迹进行检测;体积较小的载体, 可采用脱落细胞富集器粘取, 富集尽可能多的人体脱落细胞.     

应用微量DNA检验技术侦破人命案2起

目的探讨在命案侦破中如何正确应用微量DNA检验技术。方法对1例绑架杀人案和1例故意杀人案进行回顾性分析。结果案例1勒索信背面透明胶带上提取脱落细胞基因分型与嫌疑人基因分型一致。案例2中根据尸体乳头擦拭脱落细胞的STR基因分型与现场犯罪嫌疑人基因分型一致。结论正确应用微量DNA检验技术可以为案件侦破指明侦查方向,为案件侦破提供重要科学技术支撑。     

改良的碱裂解法提取动物细胞附加体DNA

目的 利用一种快速、简便的方法 提取动物细胞附加体DNA.方法 通过电转移的方法介导pEGFP-N1转染小鼠成纤维细胞NIH3T3和中国仓鼠卵巢癌细胞CHO等细胞系.转染后48 h,收集转染细胞.用STET缓冲液重悬细胞,加入碱裂解液裂解细胞,再用7.5 mol/L醋酸胺中和.离心收集上清,用1∶1酚/氯仿抽提2次,氯仿抽提1次,乙醇沉淀附加体DNA.TE溶解DNA.提取的DNA通过PCR和southern blot方法进行分析.结果 PCR和Southem blot结果证实利用改良的碱裂解法可以从动物细胞提取附加体DNA.结论 利用简便快速的碱裂解法可以提取哺乳动物细胞附加体DNA.     

3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA方法的实验研究

目的对3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA的方法进行实验研究和比较,以获得最佳的方法.方法分别采用Chelex-100小体系法、磁珠法、改良磁珠法法对脱落表皮细胞的DNA进行提取,并对检测结果进行分析比较,探讨提取接触性检材脱落表皮细胞DNA的方法.结果磁珠法和改良磁珠法均能获得较高质量的细胞核DNA STR基因座分型,且后者的分型效果更好.Chelex-100小体系法的STR基因座分型效果不佳.结论磁珠法和改良磁珠法均能有效检测接触性检材脱落细胞DNA,故在法医检案中遇到接触性检材时考虑选择改良磁珠法.     

宫颈脱落细胞HPVL1蛋白及HPV DNA载量对宫颈病变的预测价值

目的 探讨宫颈脱落细胞HPVL1蛋白、人乳头瘤病毒(HPV) DNA载量对宫颈病变的预测作用.方法 选取宫颈病变患者362例,宫颈刷采集宫颈脱落细胞,采用免疫化学方法检测HPVL1蛋白,HC2技术检测HPV DNA载量,根据宫颈组织病理学结果将患者分为慢性宫颈炎(190例)、宫颈上皮内瘤变Ⅰ期(CIN Ⅰ,45例)、宫颈上皮内瘤变Ⅱ期(CINⅡ,43例)、宫颈上皮内瘤变Ⅲ期(CINⅢ,46例)和宫颈癌(38例);根据宫颈细胞学检查结果将脱落细胞分为未见异常细胞(NILM,122例),未明确性非典型鳞状上皮细胞(ASCUS,75例),可疑非典型鳞状上皮病变细胞(ASCH,52例),低度鳞状上皮内病变(LSIL,61例)和高度鳞状上皮内病变(HSIL,52例),比较不同宫颈病变HPVL1蛋白、HPV DNA载量的差异.结果 130例宫颈脱落细胞HPVL1蛋白阳性,阳性率为35.91％(130/362),其中HPVL1蛋白阳性率由大至小分别为:慢性宫颈炎＞CIN Ⅰ期＞CINⅡ期＞CINⅢ期＞宫颈癌,NILM＞ ASCUS＞ ASCH＞ LSIL＞ HSIL,不同宫颈病变组织病理学或细胞学类型比较差异具有统计学意义(P＜0.05),272例HPV DNA阳性,阳性率为75.14％,低度HPV DNA载量以慢性宫颈炎或NILM最多,高度HPV DNA载量以宫颈癌或HSIL最多,明显高于其他宫颈组织病理学或细胞学类型(P＜0.05).结论 HPVL1蛋白在宫颈脱落细胞的表达随着宫颈病变程度加重而下调,HPV DNA载量随宫颈病变程度加重而上调,二者检测在宫颈病变程度的预测中具有重要的价值.     

L1 C-末端共同序列多肽抗体检测宫颈液基细胞学标本中人乳头瘤病毒

目的 确定由人乳头瘤病毒（HPV）主要外壳蛋白L1 C-末端保守序列多肽诱导的多肽抗体对宫颈脱落细胞内的HPV是否具有良好的检测能力。方法 收集宫颈脱落细胞,一式两份,一份采用巢氏PCR检测HPV DNA,另一份以兔抗多肽纯化抗体和小鼠抗多肽抗血清为探针做夹心法ELISA检测标本中的HPV L1,比较两种方法对HPV的检出率差异。用多肽抗体对部分标本做免疫细胞化学检测。结果 对收集到的269例宫颈脱落细胞标本用MY09/11引物扩增,检出HPV DNA阳性标本30例,检出率为11.15%;对MY09/11扩增后结果为阴性的标本再用引物GP5+/6 进行扩增。又检出阳性标本51例,检出率为21.34%。将两个PCR检测合计,共检测到81例HPV DNA阳性标本,HPV DNA总检出率为30.11%。对263例脱落细胞标本进行ELISA检测,共检出阳性标本91例,HPV阳性检出率为34.60%,与PCR检测结果相比差异无统计学意义。免疫细胞化学检测结果表明多肽抗体能够特异性地显示有HPV感染的宫颈脱落细胞。结论 HPV L1多肽抗体对宫颈脱落细胞内HPV的感染具有良好的检出能力,该抗体在开发用于宫颈癌预防性筛查的HPV检测试剂盒方面具有一定的潜力。     

图像分析仪测定胸、腹水细胞DNA含量的应用

目的:探讨胸腹水脱落细胞的DNA含量对诊断良恶性胸腹水的应用价值.方法:应用计算机图像分析仪(ICM)测定32例恶性胸腹水脱落细胞(癌细胞、恶性间皮瘤细胞)和18例良性胸腹水脱落细胞(正常和增生间皮细胞)的DNA含量,以同一涂片内成熟淋巴细胞作对照进行DI测定、倍体分析、绘制DNA直方图,计算出其恶性细胞的检出率,并与常规脱落细胞学检查作比较.结果:胸腹水中恶性肿瘤细胞(癌细胞,恶性间皮瘤细胞)的DNA含量明显增高,多为异倍体(≥5C),DI值为(3.85±1.24).间皮细胞(增生和正常间皮细胞)的DNA含量多呈二倍体,DI值为(1.35±0.23),二者差别有显著性(P＜0.01).恶性肿瘤细胞DNA分布直方图在5C处形成主峰值,间皮细胞DNA分布直方图在2C、3C处形成主蜂值.根据DNA测定结果,其恶性肿瘤细胞检出率为87.5%(28/32),常规脱落细胞学检出率为71.9%(23/32),二者联合检查检出率为90.6%(29/32).结论:ICM具有经济、方便、准确等特点,应用其测定胸腹水脱落细胞学的DNA含量,并与常规脱落细胞学相结合,可提高恶性胸腹水的检出率,对诊断及鉴别诊断良恶性胸腹水具有重要临床意义.     

食管脱落细胞DNA增殖活性的研究

目的通过流式细胞术测定食管脱落细胞DNA增殖活性指标,以探讨其在食管癌中的诊断价值.方法用食管拉网法获得41例食管癌病人和21例非食管癌病人食管脱落细胞,制成单细胞悬液,作碘化丙啶荧光染色,记录和计算组方图、DNA指数(DI)、G2/G 1、S期比率(SPF)、细胞增殖活性指数(PI)等指标,同时结合肿瘤的临床病理学特征,并与脱落细胞常规细胞学检查结果进行对比.结果 DI:食管癌组1.31±0.23,对照组1.00±0.03;异倍体(An)出现率:食管癌组70.7%,对照组4.8%;G2/G1:食管癌组2.071±0.153,对照组1.996±0.099;SPF:食管癌组28.830±15.997,对照组5.804±4.771;PI:食管癌组37.010±13.794,对照组14.738±9.703.两组上述指标的差别均有显著性意义(P＜0.05或0.01).结论食管癌组食管脱落细胞的DI、An以及PI均较对照组明显升高.食管脱落细胞DNA增殖活性指标对食管癌普查及提高早期诊断率具有一定的应用价值.     

葡萄籽提取物原花青素诱导乳腺癌MCF-7细胞脱落凋亡

目的 检测葡萄籽提取物原花青素诱导乳腺癌MCF-7细胞脱落凋亡的作用。方法 采用DNA ladder检测及软琼脂集落形成试验方法，观察乳腺癌MCF-7细胞对脱落凋亡的敏感性以及原花青素诱导其脱落凋亡的作用。结果 MCF-7细胞具有抗脱落凋亡的特性，而0．1mmol／L原花青素即可引起悬浮培养的MCF-7细胞凋亡。表现为细胞染色质DNA断裂及软琼脂集落形成受阻。结论 原花青素可诱导乳腺癌MCF-7细胞脱落凋亡。     

人胰岛素原基因的包装及增殖

目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.     

人鼻咽癌DNA对Rat-Ⅰ细胞株的转化活性及其基因表达的研究

为了解EB病毒基因组阳性人鼻咽癌DNA在转染正常细胞后可能发生的生物学作用,作者将人鼻咽癌活检组织的DNA(EB病毒基因组阳性),用磷酸钙方法转染正常Rat-Ⅰ细胞,使其恶转;用软琼脂培养的转化细胞能贴壁生长,并形成克隆;转化细胞易与PHA发生凝集;克隆接种裸鼠形成纤维肉瘤;转化细胞和裸鼠肿瘤组织用抗C_3补体免疫荧光法检测EBNA呈阳性;染色体原位杂交显示在某些细胞中期染色体上有银粒出现。     

DNA定量分析法在恶性胸腔积液诊断中的应用价值

目的探讨细胞DNA定量分析法在恶性胸腔积液诊断中的应用价值。方法将324例胸腔积液标本分别制成6张薄层细胞涂片,3张用于巴氏染色行脱落细胞学检查,3张用于经Feulgen染色行细胞DNA定量分析。结果脱落细胞学检测良、恶性胸腔积液的敏感性为61.27%,特异性为94.51%,准确率为79.94%;细胞DNA定量分析检测良、恶性胸腔积液的敏感性为95.07%,特异性为100%,准确率为97.84%。两种方法准确率比较差异有统计学意义(P=0.027)。结论细胞DNA定量分析可进一步认证脱落细胞学检查结果并弥补其不足,二者联合应用可鉴别胸腔积液的性质。     

坏变细胞的DNA对HpaⅡ限制性片段分析法测量DNA甲基化水平的干扰作用

用~3H-TdR在不同时期标记细胞DNA,以区别在HpaⅡ限制性片段放射活性分析中的DNA系来自增殖中的或坏变中的细胞.实验证明MNNG处理后存活的细胞中并无DNA甲基化水平的变化.而经MNNG或Hanks液处理的脱落细胞DNA,在HpaⅡ水解前后其DNA片段的L_w皆明显降低,并可干扰对新复制DNA的HpaⅡ识别位点的分析.因此作者认为,在缺乏严格设计以除外上述因素的体系中,作出关于细胞DNA甲基化状态变化的结论是不可信的.     

全自动图象细胞仪在肺癌痰细胞学诊断中的应用1.DNA异倍体作为标志物诊断肺癌

目的探讨全自动图像细胞仪对痰液脱落细胞DNA异倍体的检测在肺癌诊断中的价值。方法采用全自动图像细胞仪对 5 0例肺癌、30例肺结核患者和 4 0例健康人痰样中脱落细胞DNA进行定量分析 ,同时与常规痰细胞学和刷检细胞学结果进行比较。结果 5 0例肺癌患者痰样中DNA异倍体 (DI>2 .5或 5C)阳性率为 2 0 / 5 0 (4 0 % ) ,30例肺结核患者痰样和 4 0例健康人痰样均无一例阳性。肺癌患者痰样DNA异倍体阳性率高于常规痰细胞学阳性率 8/ 5 0 (16 % ) ,P <0 .0 1;也高于刷检细胞学阳性率 16 / 5 0 (32 % ) ,P >0 .0 5。结论全自动图像细胞仪对肺癌患者痰脱落细胞DNA的定量检测能够反映肺癌患者痰细胞中的恶性变化 ,对于肺癌诊断是一个敏感、特异的方法 ,可以作为肺癌诊断的辅助技术     

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

口腔粘膜脱落细胞DNA多态性分型检测在法医学应用的初步研究

目的研究各类口腔粘膜脱落细胞的微量生物性捡材中DNA提取和检验的方法,初步论证牙刷等载体作为法医物证检材的可能性。方法分别采用Chelex-100法、有机萃取法、联合抽提法三种方法提取口腔粘膜脱落细胞载体的样本DNA,进行CTTv四个STR位点单步复合扩增和两步级联扩增两种STR-PCR方式的扩增及各位点的等位基因检测。结果实验样本中,除了1例牙刷和2例牙签未能STR位点的正确分型外,其余各无关个体口腔粘膜脱落细胞载体均可以得到与标准血痕阳性相同的STR基因型。结论根据检材的PCR相对模板DNA量,选择适宜的DNA多态性检测分型方法,各类常见的含有口腔粘膜脱落细胞检材可以进行DNA检测分型,这类检材在法医检案中具有应用价值。     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

宫颈癌高发区正常妇女宫颈人乳头瘤病毒感染的初步调查(论著摘要)

人乳头瘤病毒(HPV)的感染与宫颈癌的发生密切相关,目前已分离鉴定出60多型HPV,感染宫颈上皮细胞的HPV有11、6b、16、18、31、33、35和52型等.95％以上的宫颈癌标本中能检测到HPVDNA序列,但迄今为止对HPV在正常人群中的感染情况所知甚少.山西省襄垣县是我国北方宫颈癌高发区,1990年6月笔者用膜上原位杂交法对该高发区的正常妇女人群,进行HPV感染的初步调查.具体实验步骤如下:(1)用木制宫颈刮片刮取宫颈上皮脱落细胞,先制备1张脱落细胞涂片,作Pap细胞学分级诊断.将剩余细胞用5ml高压灭菌的PBS冲洗.然后用同一刮片再刮1次宫颈,将两次刮取的细胞合并,1000r/min离心后,用1m1PBS洗1遍,离心弃上清.(2)加200μl1mg/ml蛋白酶K反应液.37℃过夜     

看似卫生 实不可取

1.用卫生纸擦拭餐具、水果和面部:许多卫生纸未经消毒处理或消毒不彻底而含有大量细菌,其粉屑很容易残留在餐具或水果上,进入人体后会影响身体健康,切不可当做消毒巾使用;将卫生纸用于擦脸更不卫生,容易导致脸部皮肤病。2.用抹布擦拭餐具和水果:在一般家庭,抹布是多用途的,既用其擦桌子又用其抹餐具。如不经常消毒、清洗或晾晒,潮湿的抹布则     

汽车安全气囊上微量检材DNA检测方法的探讨

目的探讨汽车安全气囊上微量人体脱落上皮细胞DNA检测的有效方法.方法分别采用棉线载体直接扩增法、小体积Chelex-100法和磁珠法对汽车安全气囊上提取的微量人体脱落上皮细胞的DNA进行检测,并对检测结果进行分析比较,以获得有效方法.结果棉线载体直接扩增法和磁珠法均能得到满意的人体脱落上皮细胞核DNA STR基因座分型结果,小体积Chelex-100法不能获得STR基因座分型结果.结论棉线载体直接扩增法和磁珠法均能有效地检测微量人体DNA,获得STR基因座分型结果,提高DNA检出率,操作简单、节约时间和试剂成本,特点在法医物证学实际检案工作中具有较高的应用价值.