原核表达的重组人骨形态发生蛋白7增高牙槽嵴的实验

背景:牙齿缺失后,牙槽骨内成骨与破骨的动态平衡被打破,牙槽嵴呈现出不可逆转的骨吸收,其后果是大量的牙槽骨丢失;骨形态发生蛋白在骨及牙齿的生长发育和创伤修复中发挥重要作用。目的:观察原核表达的重组人骨形态发生蛋白7对增强牙槽嵴的新骨形成、预防牙槽嵴吸收的作用。设计:对照实验。单位:济南市口腔医院正畸科,山东省医学科学院。材料:实验于2003-06/2004-12在山东省医学科学院完成,采用新西兰大白兔28只,雌雄不限,体质量平均2kg。方法:采用大白兔建立动物拔牙创模型,将大白兔分别拔除左、右下门牙,将骨形态发生蛋白7复合载体2块40μg植入右下门牙(为实验组),仅含磷酸盐缓冲液的空载体2块40μg植入左下门牙(为对照组),术后2,4,8及12周处死动物,取标本进行扫描电镜分析、钙含量及碱性磷酸酶活性测定。主要观察指标:①扫描电镜分析结果。②碱性磷酸酶活性及钙含量。结果:①电镜照片结果:实验组的骨创愈合比对照组提前4～6周。②碱性磷酸酶活性:实验组均明显高于对照组[2周:(38.191±5.384),(19.821±2.084)μkat/g;4周:(160.815±9.669),(126.709±1.634)μkat/g;8周:(378.892±13.086),(225.212±1.884)μkat/g,P<0.01]。③钙含量:实验组均明显高于对照组[2周:(5.592±0.110),(0.913±0.064)mg/g;4周:(8.654±0.177),(1.702±0.071)mg/g;8周:(25.326±0.287),(5.980±0.145)mg/g,P<0.01]。结论:原核表达重组人骨形态发生蛋白7具有良好的增高牙槽嵴、促进拔牙创愈合的作用。     

牵张成骨增高山羊牙槽嵴动物模型建立的研究

目的：采用山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区构建牵张成骨增高牙槽嵴的动物实验模型，并研究此模型的有效性及可行性。方法：陕西关中山羊6只，选取一侧山羊下颌无牙区至下颌第一前磨牙根尖下方行矩形截骨，安装骨牵张器，间歇7d后牵张增高牙槽嵴，1次／d，1mm／次，共加力8d。分别固定4，8周后取材。行X线，临床大体和组织学观察。结果：平均牙槽嵴增高分别为7．5，7．Omm；X线片示：牵张后4周，牵张间隙已被新生骨组织所充填，新生骨较原有骨密度低。牵张后8周，新生骨密度与旧骨相同。组织学观察显示：牵张后8周有成熟的骨小梁及骨皮质形成。牵张区牙齿牙髓结构正常。结论：山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区可作为牵张成骨增高牙槽嵴新的实验动物模型。     

牵张成骨增高山羊牙槽嵴动物模型建立的研究

目的:采用山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区构建牵张成骨增高牙槽嵴的动物实验模型,并研究此模型的有效性及可行性。方法:陕西关中山羊6只,选取一侧山羊下颌无牙区至下颌第一前磨牙根尖下方行矩形截骨,安装骨牵张器,间歇7d后牵张增高牙槽嵴,1次/d,1mm/次,共加力8d。分别固定4,8周后取材。行X线,临床大体和组织学观察。结果:平均牙槽嵴增高分别为7.5,7.0mm;X线片示:牵张后4周,牵张间隙已被新生骨组织所充填,新生骨较原有骨密度低。牵张后8周,新生骨密度与旧骨相同。组织学观察显示:牵张后8周有成熟的骨小梁及骨皮质形成。牵张区牙齿牙髓结构正常。结论:山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区可作为牵张成骨增高牙槽嵴新的实验动物模型。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的：采用多聚酶链反应及酶切鉴定，拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体，以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。 方法：实验于2004-05／2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118．BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3．1／CT-GFP质粒中。酶切回收的BMP-7／GFP基因片段，克隆人pAxCAwt腺病毒载体后，共转染大肠杆菌LE393，获得腺病毒重组质粒，大量扩增后转入293细胞包装，获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞，293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。 结果：①骨形态发生蛋白7基因的获得：KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带，略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因，略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3．1BMP-7／GFP的构建：所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带，全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT．BMP-7．GFP的构建：所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带，为正向插入的阳性克隆。 结论：多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建，并包装出重组腺病毒，为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在小鼠成肌细胞中的表达

目的：构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体(AdBMP7)，并观察其在小鼠成肌细胞C2C12细胞中的表达情况。方法：实验于2004—05／10在北京大学医学部完成。RT-PCR方法从HKE293细胞中克隆出hBMP7 cDNA并亚克隆人穿梭质粒pAdtraekcmv中，构建pAdtrackcmv-hBMP7质粒。该质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组后挑选阳性重组体pAd—hBMP7质粒。线性化pAd-hBMP7质粒转染293A细胞后检测病毒噬斑形成情况，并于转染后9d收获病毒，大量扩增并制备高纯度、高滴度的AdBMP7。将AdBMP7按MOI=100来感染C2C12细胞，48h后分别应用RT-PCR和免疫组化方法来检测hBMP7在mRNA和蛋白水平的表达。结果：成功克隆出hBMP7 cDNA，酶切鉴定pAdtraekcmv-hBMP7和pAd-hBMP7质粒正确重组，获得纯化后滴度达到5&;#215;10^12vp／mL的AdBMP7。AdBMP7能有效感染C2C12细胞并表达hBMP7蛋白。结论：应用AdEasy-1腺病毒载体系统可在短期内制备高滴度的携带GFP和hBMP7的重组腺病毒AdBMP7，并在为进一步研究BMP7基因治疗促进骨愈合打下基础。     

动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的：利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒，并进行体内表达，测定活性；为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法：实验于2000—05／2002—06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PcR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因，体外同源重组构建重组腺病毒后，随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组，每组15只，将纯化后的重组腺病毒50μL注入sD大鼠股部肌肉陷窝病损处，通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果：6周后治疗组可见明显骨诱导形成，2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论：应用于动物实验中目的基因表达，并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试，且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功，也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的:采用多聚酶链反应及酶切鉴定,拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体,以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。方法:实验于2004-05/2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118.BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,酶切回收的BMP-7/GFP基因片段,克隆入pAxCAwt腺病毒载体后,共转染大肠杆菌LE393,获得腺病毒重组质粒,大量扩增后转入293细胞包装,获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞,293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。结果:①骨形态发生蛋白7基因的获得:KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带,略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因,略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3.1BMP-7/GFP的构建:所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带,全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT.BMP-7.GFP的构建:所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带,为正向插入的阳性克隆。结论:多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建,并包装出重组腺病毒,为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

三种不同载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应

目的：比较牛松质骨粒、磷酸三钙、天然珊瑚载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应。方法：实验于1998-12／2002—06在第四军医大学骨科实验室完成。①重组人骨形态发生蛋白2与牛松质骨粒、天然珊瑚和磷酸三钙按相同比例复合形成3种载体释放系统。②取昆明小鼠90只，随机分为3组，牛松质骨粒组、天然珊瑚组和磷酸三钙组，每组30只。于小鼠股部肌袋一侧植入重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统，另一侧单纯植入0．2mg重组人骨形态发生蛋白2。③分别于植入后7，14，21d周麻醉状态下每组各处死10只，取材行组织学检查、成骨量分析和碱性磷酸酶活性测定。结果：90只小鼠全部进入结果分析。①组织学检查术后不同时间牛松质骨粒组和磷酸三钙组成软骨和成骨能力较强，而天然珊瑚组成骨能力稍差。21d的成骨量分析显示牛松质骨粒组、磷酸三钙组和天然珊瑚组分别较对照组成骨量放大了5．47倍、4．90倍和1，65倍。②牛松质骨粒组、磷酸三钙组之间碱性磷酸酶活性没有显著差异（P〉0．05），均显著大于天然珊瑚组（P〈0．05），3组的碱性磷酸酶活性高峰出现在术后第21天[依次为（285．09&;#177;52．29），（256．48&;#177;45．99），（177．92&;#177;22．69）nkat／g]。结论：比较3种不同的重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统。异种松质骨粒表现较强的成骨能力，提出载体放大效应应成为重组人骨形态发生蛋白2载体选择标准之一。     

自体骨膜包绕肌腱复合人重组骨形态发生蛋白-2替代月骨的实验研究

目的：研究用自体骨膜包裹肌腱复合人重组骨形态发生蛋白-2(dHBMP-2)植入物替代月骨治疗Kienbock’s病的可行性。方法：选新西兰白兔45只，按每组15只随机分为骨膜组、rhBMP-2复合体组和对照组。将3种植人物分别植入兔膝关节腔内，术后1，3，6，12和16周时取材，组织学观察骨形成并测量骨密度值(BMD)。结果：rHBMP-2组骨和软骨形成比骨膜组明显；对照组呈玻璃样变性，无骨形成。标本BMD值经统计学分析，骨膜组、rhBMP-2组和对照组间差异有非常显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：在骨膜和rhBMP-2诱导因子作用下rhBMP-2复合体组骨形成较强，在较短时间内形成大量骨和软骨，可用作月骨替代物。     

骨形态发生蛋白诱导基因克隆和表达的实验研究

目的:用基因工程技术在大肠杆菌中表达骨形态发生蛋白诱导基因(BMP-2-inducedgene3kbgene,BIG-3)所编码的蛋白。方法:依据Genbank中BIG-3的基因序列设计并合成引物,从新生小鼠颅骨组织中提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到BIG-3全长编码序列。将所得到的基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,经测序证实后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,挑选阳性克隆,经诱导表达后SDS-PAGE鉴定。结果:克隆得到BIG-3全长编码序列并在大肠杆菌中表达了GST-BIG-3融合蛋白,融合蛋白约占菌体总蛋白的45.3%。结论:通过RT-PCR从新生小鼠颅骨中克隆到BIG-3基因并在大肠杆菌中获得GST-BIG-3融合蛋白的高水平诱导表达。     

缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导骨形成

背景：重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短、易降解代谢,达不到理想的骨再生效果。目的：制备缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料,并观察其缓释性能、骨诱导活性。方法：将重组人骨形态发生蛋白2与壳聚糖混合制备壳聚糖膜,涂覆于生物骨修复材料表面,ELISA方法检测其体外释药性能。茜素红染色检测缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料、单纯骨填充材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白的形成,观察其诱导成骨细胞能力。同时将3种骨修复材料植入清洁级KM小鼠股部肌袋内,2周后检测新生骨Ca2＋离子含量,评价其异位骨诱导能力。结果与结论：材料表面的壳聚糖膜分布均匀,负载的重组人骨形态发生蛋白2呈团簇状。重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料体外释药存在突释,前4d释放量达总药量的50%,持续至12d,释药量达到90%,第18天时释放完全。与单纯骨填充材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料相比,缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化能力与异位骨形成能力显著增强（P〈0.05）。结果提示缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料缓释性能好,促进骨形成能力强。     

重组人骨形态发生蛋白2缓释微球的制备与评价

目的:针对重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)在体内半衰期短、易被稀释代谢的问题,探讨利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备载rhBMP-2微球的可行性和制备工艺,并观察其载药、释药特性.方法:①采用W/O/W型复乳化-溶剂挥发技术制备rhBMP-2/PLGA缓释微球,并对微球的粒径和形态、包封率和载药量,体外释放性质进行测定.②异位成骨实验:昆明小鼠12只,在右侧大腿股内侧肌袋内植入含rhBMP-2的50 mg PLGA微球,4周后取材,观察成骨情况以初步检测微球中的蛋白质活性.结果:①rhBMP-2/PLGA缓释微球形态良好,粒径主要集中在50～60 μm,包封率为(37.52±4.31)%,载药率为(5.12±1.32)%.②微球的释放存在突释,7 d内释放的药物量超过40%,大约90%的药物量于42 d内释放完全.③载药微球植入鼠股部肌袋4周,材料周围有明显的骨形成.结论:制备的rhBMP-2/PLGA微球可以缓慢释放有活性的rhBMP-2,具有临床应用的可行性.     

缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导骨形成

背景:重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短、易降解代谢,达不到理想的骨再生效果。目的:制备缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料,并观察其缓释性能、骨诱导活性。方法:将重组人骨形态发生蛋白2与壳聚糖混合制备壳聚糖膜,涂覆于生物骨修复材料表面,ELISA方法检测其体外释药性能。茜素红染色检测缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料、单纯骨填充材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白的形成,观察其诱导成骨细胞能力。同时将3种骨修复材料植入清洁级KM小鼠股部肌袋内,2周后检测新生骨Ca2+离子含量,评价其异位骨诱导能力。结果与结论:材料表面的壳聚糖膜分布均匀,负载的重组人骨形态发生蛋白2呈团簇状。重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料体外释药存在突释,前4d释放量达总药量的50%,持续至12d,释药量达到90%,第18天时释放完全。与单纯骨填充材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料相比,缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化能力与异位骨形成能力显著增强(P<0.05)。结果提示缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料缓释性能好,促进骨形成能力强。     

Osteoinduction by recombinant human bone morphogenetic protein-2 in muscles of non-human primates

Heterotopic osteoinduction in a muscle of a medium-sized, non-human primate (Japanese macaque monkey; Macaca fuscata) was investigated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) mixed with atelopeptide type I collagen as the carrier. Nine monkeys were divided into three groups of three: groups I (1.25 mg rhBMP-2), II (250 micrograms rhBMP-2) and III (50 micrograms rhBMP-2). Four weeks after implanting into the calf muscle pouch, the implant was examined radiographically and histologically. In one specimen of three in group I, marked radio-opaque shadow, massive chondrogenesis and partial osteogenesis were observed. In the other two specimens, only microscopic calcification signs were recognized. In groups II and III, no findings of heterotopic osteoinduction were radiographically observed; however, nuclei from muscle bundles reacted to rhBMP-2 and were large and round, as in muscle bundles near the site of osteogenesis in group I. A positive control study using rats was carried out in parallel. This was a dose-finding study, with the monkeys in group III acting as a sub-effective dose (placebo) control, and rats acting as an active control, or verum, to show that the techniques are sufficiently sensitive. Bone morphogenetic protein appears to osteoinduce less bony material in soft tissue in primates than in rats.     

重组人骨形态发生蛋白2缓释微球的制备与评价

目的：针对重组入骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）在体内半衰期短、易被稀释代谢的问题，探讨利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）制备载rhBMP-2微球的可行性和制备工艺，并观察其载药、释药特性。方法：①采用W／O／W型复乳化-溶剂挥发技术制备rhBMP-2／PLGA缓释微球，并对微球的粒径和形态、包封率和载药量，体外释放性质进行测定。②异位成骨实验：昆明小鼠12只，在右侧大腿股内侧肌袋内植入含rhBMP-2的50mgPLGA微球，4周后取材，观察成骨情况以初步检测微球中的蛋白质活性。结果：①rhBMP-2／PLGA缓释微球形态良好，粒径主要集中在50—60μm，包封率为（37．52±4．31）％，载药率为（5．12±1．32）％。②微球的释放存在突释，7d内释放的药物量超过40％，大约90％的药物量于42d内释放完全。③载药微球植入鼠股部肌袋4周，材料周围有明显的骨形成。结论制备的rhBMP-2／PLGA微球可以缓慢释放有活性的rhBMP-2，具有临床应用的可行性。     

含重组人骨形态发生蛋白2骨修复材料的体内成骨实验

背景：以往的骨修复材料都优先考虑生物材料对骨缺损的骨传导作用，而含重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的骨修复材料（骨优导）修复骨缺损的作用机制为骨诱导（诱导成骨）作用。目的：采用两种动物模型观察骨修复材料（骨优导）的体内成骨活性。设计：分组对比，多角度评估观察实验。材料：rhBMP-2和载体材料制备的骨修复材料（骨优导）由杭州华东医药集团投资有限公司提供。方法：①小鼠肌袋异位成骨实验：ICR小鼠72只随机分为rhBMP-2材料5，10，20，40，80，160，250μg组、空白对照组和假手术组9组，后腿外侧肌肉间隙陷窝分别植入相应剂量的骨优导或空白材料，或做假手术。②犬桡骨骨缺损修复实验：30只犬随机分为rhBMP-2材料1,2，4mg组、空白对照组、造模组5组，制备桡骨2cm骨缺损模型，分别植入相应剂量的骨优导或空白材料，造模组不处理。主要观察指标：①小鼠植入材料当天和植入后21d拍X射线片观察，21d后取材，测定新骨的湿重，干重，灰份含量、钙含量。②犬植入后当天、植入后1，2，3个月拍X射线片观察，并对骨愈合情况进行量化后评分。结果：植入骨修复材料（骨优导）的小鼠在植入后21d解剖发现植入部位有大量新骨形成，而新骨的干重、湿重、灰分含量、钙含量都和植入的rhBMP-2剂量成线形正比。在犬桡骨骨缺损模型中观察到植入骨优导后1个月，植入区域有明显的新骨形成，植入3个月后愈合良好，两个对照组均未能愈合。量化评分显示rhBMP-2可加速骨缺损修复。结论：骨修复材料（骨优导）有较强的诱导成骨活性和修复骨缺损作用，具有很好的临床应用前景。     

采用放射性骨显像评价rhBMP-2与珊瑚人工骨复合植入狗牙槽骨后的成骨效能

目的探讨应用^99Tom—MDP放射性骨显像评价重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）与珊瑚人工骨在体外复合后植入狗缺损牙槽骨中后的成骨效应。方法拔除12只成年狗两侧上颌第二及第三切牙,并去除牙槽窝之间的牙槽间隔,一侧随即植入复合骨,对侧植入珊瑚骨作为对照。并于分别于植入后4、8、12周后取材,采用组织学观察、图像分析和^99Tom—MDP核素骨显像等方法比较两种类型的骨移植材料在牙槽窝中的骨修复能力。结果复合骨植入牙槽骨后,材料被逐渐降解吸收,新骨不断生成,12周后,植入材料完全被成熟的骨组织取代;图像分析结果显示不同时间复合骨组新骨形成的比值显著高于单纯珊瑚骨组（P〈0．05）;4周和8周复合骨组核素浓聚程度高于珊瑚骨组,12周两组核素浓聚程度差异不明显。结论^99Tom—MDP放射性骨显像能早期判断移植骨的成活情况及成骨效果。