自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立

【目的】构建自噬基因Beclin1启动子报告基因细胞自噬模型,为筛选出以Beclin1为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染双荧光素酶报告基因测定法,确定最佳转染浓度、时间等条件,及Beclin1基因启动子转录活性细胞自噬模型的建立和验证,观察血清饥饿、过氧化氢氧化损伤及自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素对Beclin1基因启动子转录活性PC12细胞自噬模型的影响。【结果】血清饥饿诱导12 h,Beclin1基因启动子转录活性是体积分数10%血清组的1.8倍,而血清饥饿诱导18、24 h与诱导12 h比较其转录活性无明显变化;300μmol/L过氧化氢诱导9 h,Beclin1基因启动子转录活性是0μmol/L过氧化氢组的1.3倍;雷帕霉素在浓度0.1、1 nmol/L可上调Beclin1基因启动子转录活性,并呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度的雷帕霉素可下调Beclin1基因启动子转录活性。【结论】成功建立用Beclin1基因启动子报告基因检测Beclin1基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型,血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导Beclin1基因启动子的转录活性。     

p53基因的原核表达与活性测定

目的 原核表达P53重组蛋白,检测P53蛋白对人类白血病细胞系K562增生的影响.方法 运用PCR技术鉴定了pET-p53重组质粒导人BL21菌株中p53基因的存在,并在IPTG的诱导下,大量产生外源基因产物.通过Ni-NAT亲和层析柱纯化分离P53蛋白,SDS-PAGE确定该蛋白准确性.以不同浓度的P53重组蛋白诱导K562细胞后,用MTT比色法、集落形成法、流式细胞术(FCM)测定P53蛋白对靶细胞增生的影响.结果 成功地构建了含人野生型p53基因的原核表达载体,纯化了P53重组蛋白.活性测定结果表明,随着P53重组蛋白浓度的增加,K562细胞存活率显著降低,并发现该蛋白能促进肿瘤细胞凋亡,且呈现明显的剂量依赖性,经相关分析,细胞抑制率与P53蛋白浓度呈正相关(r=0.8981),其半数抑制浓度(IC50)为6.74μg/ml.结论 P53重组蛋白具有促进K562细胞凋亡的作用.     

低剂量三氧化二砷对HepG2细胞p53基因转录水平的下调作用

目的：探讨低剂量三氧化二砷（As2O3）对p53启动子转录活性的调节作用。方法：确定p53启动子区域,聚合酶链反应（PCR）扩增p53p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-p53p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性;并以小同浓度三氧化二砷刺激HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果：成功克隆出614bp的新的p53启动子,pCAT3-p53p和不同浓度的三氧化二砷（0．25hcmoL／L）瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCATF3-Basic守载体的11．2倍,表明pCAT3-p53p具有强的启动子活性。选用0．25、0．5、2．5、5．0μmol／L浓度的三氧化二砷刺激pCAT3p53p转染的HepG2细胞,其CAT吸光度值分别为：0．076、0．186、0．149、0．1l9,CAT活性随着三氧化二砷浓度的倍增呈衰减趋势。结论：p53启动子有反式激活下游基因表达的活性,低剂量：三氧化二砷对p53基因转录水平具有下调作用。     

低氧调控p53 RFP基因启动子活性的初步研究

目的 观察低氧对p53RFP基因表达及启动子活性的影响,探索低氧反应元件(HRE)是否参与了低氧对p53RFP基因启动子活性的调控。方法 将HEK293细胞置于低氧条件下培养,实时定量PCR及Western blot检测p53RFP mRNA及蛋白表达水平;通过定点突变技术构建HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体并转染HEK293细胞,分别置于常氧和低氧条件下培养,双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。结果 低氧处理不同时间点p53RFP mRNA表达水平均显著增加,差异有统计学意义(F=96.493,P<0.001);低氧组p53RFP及HIF-1α蛋白表达量均呈时间依赖性递增。成功构建了HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶报告基因检测显示,与常氧组相比,低氧条件下野生型p53RFP基因启动子活性增加(t=-19.504,P<0.001),HRE单突变或双突变后启动子活性均较野生型降低(F=160.891,P<0.001)。结论 低氧可诱导p53RFP基因表达上调;成功构建了HRE突变型p53RFP双荧光素酶报告基因载...     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

端粒酶逆转录酶基因启动子的克隆及其转录活性的检测

端粒酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶,催化合成端粒的DNA重复序列,并引导端粒添加到染色体的尾端,对维持染色体的长度、调节细胞增殖和凋亡起重要作用[1]。正常人的体细胞中通常检测不到端粒酶的活性,而约90％的肿瘤细胞的端粒酶活性却大大增强[2]。因此,端粒酶是肿瘤治疗的一个很有吸引力的靶子。端粒酶的核心结构包括RNA和具有逆转录酶活性的催化蛋白(telomerase reverse transcrip-tase,TERT)。业已证明,TERT是决定端粒酶活性的主要因素[3,4]。本研究通过PCR的方法克隆了TERT基因的启动子,并鉴定其在各种肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性。     

p53基因敲除对细胞迁移的影响

目的 研究p53基因敲除对细胞迁移的影响.方法 观察p53 / 和p53细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响.结果 在血清诱导下,p53 / 细胞能形成板状伪足和进行迁移,而p53细胞中板状伪足的形成和细胞迁移都被阻断.结论 p53在血清诱导的细胞迁移中具有重要作用.     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

子宫内膜癌中细胞凋亡和p53基因的表达

目的 探讨细胞凋亡在子宫内膜癌发生发展中的作用。细胞凋亡与抑癌基因p53表达产物的关系。以及p53蛋白表达与预后相关性。方法 应用免疫组织化学方法和TUNEL技术，对子宫内膜腺癌癌变过程中各种病变组织中p53蛋白和细胞凋亡进行测定。结果 正常增生期子宫内膜有偶发凋亡，早期子宫内膜癌和晚期子宫内膜癌的细胞凋亡率分别为1.82%和3.86%，p53蛋白在正常增生期子宫内膜，早期子宫内膜癌和晚期子宫内膜癌的表达率分别为8.31%,38.9%和57.1%。p53蛋白阴性组细胞凋亡率明显高于p53蛋白阳性组。结论 细胞凋亡参与子宫内膜癌的发生发展，子宫内膜癌细胞凋亡受p53基因调控，p53蛋白可能成为评判预后的指标。     

肝癌细胞转染野生型p53基因稳定表达后肝癌细胞出现自发凋亡

肝癌细胞转染野生型ｐ５３基因稳定表达后肝癌细胞出现自发凋亡＊张晓东１王文亮１穆峰２（１第四军医大学病理学教研室西安７１００３３２第四军医大学唐都医院胸外科）关键词肝肿瘤细胞凋亡ｐ５３基因转染中图号Ｒ７３－３１目的进一步探讨ｐ５３基因与细胞凋亡（ａｐｏ...     

食管癌p53基因突变的研究

应用非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法分析了３０例食管癌患者癌组织及相应癌旁组织Ｐ５３基因第５－９外显子，结果发现８例癌组织存在Ｐ５３基因突变。其中的４例为Ｐ５３基因杂合性丢失。部分癌旁组织检测到Ｐ５３基因突变，实验结果表明，Ｐ５３基因突变可能是分管癌癌变的早期遗传学损害，对食管癌的发生起重要作用。     

食管鳞癌p53基因突变和p53功能失活的对照研究

目的研究食管鳞癌p53基因突变在p53功能失活中所占的比例,并初步探索食管鳞癌p53功能失活的原因。方法对45例新鲜食管鳞癌组织（正常食管组织作为对照）进行p53基因突变检测（p53-PCR-SSCP法）、p53sD能失活检测（p53SD能测定法）以及2种p53结合蛋白MDM2和HPV16／18-E6的表达检测（免疫组化sP法）。对上述结果进行统计学分析。结果p53功能失活率为64％,p53基因突变平为49％;p53基因无突变组中,p53功能失活者HPV16／18--E6表达率高于p53功能正常者,也高于p53基因突变组l而3组间MDM2表达率无统计学差异。结论食管鳞癌p53SD能失活率高于p53基因突变率,p53sD能失活有望成为一种评价食管鳞癌生物学特性的新指标;食管鳞癌p53功能失活的原因可分为p53基因突变和非基因突变原因,前者占72％,后者占28％。在非基因突变原因中可能存在p53结合蛋白HPV16／18-E6的参与,而不存在MDM2的参与。     

稳定表达外源性p53基因U14细胞系的建立及鉴定

目的建立稳定表达外源性p53基因的U14细胞系。方法将提取的含p53质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U14细胞，经含G418选择培养基筛选得到稳定转染的细胞系．用间接免疫细胞化学法鉴定外源性p53基因的表达情况。结果筛选得到的U14细胞系可检测到外源性p53蛋白的表达。结论建立了稳定表达外源性p53基因的U14细胞系，为进一步研究p53基因用于肿瘤免疫治疗奠定基础。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，为进一步研究野生型ｐ５３蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡提供体外实验模型。方法：用ＤＮＡ转染技术将ＰＭ４７质粒，它是一种含激素诱导启动的鼠乳腺肿瘤病毒启动子和生化选择标志基因Ｅｃｏｇｐｔ的重组野生型ｐ５３ｃＤＮＡ质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２中，用ｇｐｔ选择培养基筛选阳性细胞克隆。结果：成功地将外源性野生型ｐ５３ｃＤＮＡ重组质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２细胞中，在ｇｐｔ选择培养基中培养２周后生长出阳性细胞克隆，命名为ＯＳ－７３２－Ｐ。结论：利用基因转染技术能将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，并能在选择培养基中生长     

p73、p63及p53基因表达与喉鳞状细胞癌预后相关性分析

目的 探讨p73、p63和p53蛋白在喉鳞状细胞癌发生、发展中的作用与意义,为喉鳞癌的临床诊断及治疗提供新的思路,并为基因治疗的探索提供理论依据.方法 采用免疫组织化学(S-P法)检测p73、p63、p53蛋白在50例喉鳞状细胞癌、10例癌旁组织及10例正常喉黏膜中的表达,分析3种基因蛋白与喉鳞癌的临床病理特征之间的关系.结果 (1)p73表达与局部淋巴结转移成正相关(P<0.01).p73阳性表达的患者生存率相对较低(P<0.05).(2)p63表达与临床分期成负相关(P<0.05),与其他临床特征及生存率无关(P>0.05).(3)p53表达与各临床特征均无关,p53阳性表达的患者生存率相对较低(P<0.05).结论 (1)喉鳞状细胞癌中的p73过表达可能与局部淋巴结转移有关.p73阳性表达可能是患者预后不良的指标.(2)p63过表达的肿瘤恶性度可能相对较低,p63的表达与患者预后无直接联系.(3)p53阳性表达的患者预后较差.(4)提示p53家族可能和喉鳞状细胞癌形成的早期阶段有关.     

卵巢癌细胞凋亡和细胞倍性与p53基因突变的关系

目的了解Ｐ５３基因突变、细胞倍性、细胞凋亡三者的关系,探讨突变型Ｐ５３基因在肿瘤发生中的作用机制。方法应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测２０例正常卵巢组织、２０例良性卵巢肿瘤、４５例恶性卵巢癌（其中肿瘤未转移组２０例,肿瘤转移组２５例）患者的Ｐ５３基因突变,流式细胞仪Ｆａｃｓｃａｎ检测卵巢癌细胞染色体倍性,凋亡率及其在细胞周期各相中的分布情况。结果卵巢癌转移组的Ｐ５３基因突变率为６０％,未转移组为４０％（Ｐ     

卵巢癌细胞凋亡和细胞倍性与p53基因突变的关系

目的　了解p53基因突变、细胞倍性、细胞凋亡三者的关系,探讨突变型p53基因在肿瘤发生中的作用机制。方法　应用PCR-SSCP检测20例正常卵巢组织、20例良性卵巢肿瘤、45例恶性卵巢癌(其中肿瘤未转移组20例,肿瘤转移组25例)患者的p53基因突变,流式细胞仪Facscan检测卵巢癌细胞染色体倍性、凋亡率及其在细胞周期各相中的分布情况。结果　卵巢癌转移组的p53基因突变率为60％,未转移组为40％(P>0．05);其中p53基因突变组肿瘤细胞凋亡率(20．25％)明显低于未突变组肿瘤细胞凋亡率(41．68％)(P<0．05);p53基因突变组异倍体细胞百分率(73．9％)明显高于未突变组(36．4％,P<0．05);另外,异倍体细胞较二倍体细胞更容易发生转移(P<0．05);异倍体肿瘤细胞凋亡率为36．1％,二倍体肿瘤细胞凋亡率为42．0％,二者差异无显著性(P>0．05)。结论　 p53基因突变使肿瘤细胞凋亡率下降,进而促进肿瘤发生发展。p53基因突变多见于异倍体细胞,细胞凋亡率与细胞倍性无关。     

α干扰素对A_(549)细胞端粒酶活性和p53蛋白的表达

目的 :探讨α 干扰素 (IFN α)对人肺腺癌细胞株A549细胞端粒酶活性和p5 3蛋白质表达的影响。方法 :用两种不同质量浓度IFN α(2 5 μg L ,10 0 μg L)处理人肺腺癌细胞株A549细胞 ,并设空白对照。采用TRAP 银染法检测端粒酶活性 ,用免疫荧光标记法测定p5 3蛋白的表达。结果 :IFN α作用后的A549细胞 ,端粒酶活性明显降低 ,且p5 3蛋白表达明显减少。结论 :IFN α能抑制肺腺癌细胞的端粒酶活性和p5 3蛋白的表达