人结肠腺癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化

目的优化人结肠癌Lovo细胞系的蛋白质样品制备方法,建立人结肠癌Lovo细胞系的双向凝胶电泳(2-DE)图谱.方法分别用磷酸盐缓冲液和等渗蔗糖溶液冲洗细胞,胰酶酶解后裂解和皿上直接裂解的方法提取所培养Lovo细胞的总蛋白质,利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析2-DE图谱.结果以等渗蔗糖缓冲液冲洗细胞并经皿上直接裂解的方法所提取Lovo细胞总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人结肠癌Lovo细胞系2-DE图谱.结论以等渗蔗糖溶液冲洗细胞结合皿上直接裂解是一种较好的细胞蛋白质双向电泳样品制备方法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人结肠癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的优化人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质样品制备方法,建立其亚细胞蛋白质组双向电泳技术。方法分步提取人肝癌细胞株QGY-7701细胞质、细胞膜和细胞核蛋白,采用不同的方法除盐、浓缩样品,然后分别采用2种不同的水化上样缓冲液重悬样品,进行双向凝胶电泳。结果使用三氯乙酸/丙酮的除盐效果好,样品损失少;采用上样缓冲液(7mol/L尿素 2mol/L硫脲 4%CHAPS 40mmol/L Tris 65mmol/L DTT 2%两性电解质)有利于蛋白的溶解,获得更多的蛋白信息,检出的细胞质蛋白点数可达(995±53),细胞膜蛋白点数可达(1035±58),细胞核蛋白点数可达(893±45)。结论获得了清晰的人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳图谱。     

尿蛋白质组双向电泳的样品制备

目的 建立与优化非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者尿液全蛋白双向凝胶电泳技术(2-DE).方法 采用4种不同的方法制备尿液蛋白质样品,以非线性预制胶条进行第一向等电聚焦,12%的SDS-PAGE进行第二向电泳,银染显色.结果 以乙腈沉淀蛋白后经过超滤制备的蛋白质样品,在300μg上样量时,可获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.结论 建立了较稳定的非小细胞肺癌患者尿蛋白质组双向凝胶电泳技术.     

PCR提取DNA方法的改进

们改进了聚合酶键反应（PCR）提取DNA的方法，并用于骨髓增生异常综合征（MDS）P53基因和降钙素基因（CT基因）甲基化的研究，获得满意的PCR扩增效果。步骤如下：将组织培养细胞收集于试管中，用缓冲液（145mmol／LNaCl、66mmol／LNa3PO4、pH7．0）充分洗涤2～3次后，置于Ep管中，将0．5ml骨髓（血）和0．5ml裂解缓冲液（0．32mol／L蔗糖10mmol／LTris－HClpH7．5，5mmol／LMgCl2、1％TritonX－100）在1．5mlEp管中充分混匀，13000g离心去上清，重复3～4欢。用无菌手术刀剖净骨髓涂片上的血膜，置于1．5mlEp管中。然后向Ep…     

大鼠脊神经蛋白质组研究中双向电泳技术的建立

目的探讨双向凝胶电泳技术在大鼠脊神经组织蛋白质组研究中的应用。方法应用高蛋白溶解度裂解液提取正常大鼠脊神经组织蛋白质，以固相pH梯度等电聚焦电泳和垂直板SDS-PAGE电泳结合的方法进行蛋白质的分离，使用银染和考马斯亮蓝两种方法分别对凝胶进行染色。结果正常大鼠脊神经组织样品在18cmpH3～10非线性固相pH梯度干胶条，12．5％的Acr-Bis PAGE的胶上可分离到900个左右蛋白点，不同凝胶间蛋白点平均匹配率为80％。结论实验所采用的高离液剂体系的裂解液，及对第一向和第二向电泳过程中各个因素及环节的把握，是获得大鼠脊神经组织蛋白质双向电泳图谱的关键。     

氯丙嗪对体外培养人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用

目的：探讨氯丙嗪对人宫颈癌Hela细胞株的体外抑制作用。方法：采用MTT测定法，观察不同浓度氯丙嗪(0μmol／L，3．0μmol／L，6．0μmol／L，12．5μmol／L，25．0μmol／L，50．0μmol／L，100．0μmol／L)作用后体外培养的人宫颈癌Hela细胞的细胞增殖抑制率，并于用药后不同时间点观察细胞形态学变化。结果：不同浓度的氯丙嗪对Hela细胞生长均有抑制作用，随药物浓度的增加，抑制作用加强。氯丙嗪浓度为3．0μmol／L即呈现明显的生长抑制作用，抑制率为7．91％；浓度为100．0μmol／L时抑制率最高，达59．39％。用药4h后镜下即可见部分细胞贴壁性降低，肿胀呈球形，核膜溶解，不见核的轮廓；部分细胞裂解呈碎片状；用药8h后碎片明显增多。结论：氯丙嗪对人宫颈癌Hela细胞株具有体外生长抑制作用。     

HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化与图谱的建立

目的：优化双向电泳的样品处理方法,建立HepG2细胞蛋白质双向电泳图谱。方法：用含10%胎牛血清的RPM11640培养液培养HepG2细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,冰浴超声离心后取上清液进行双向凝胶电泳,电泳图谱经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析。结果：通过对HepG2细胞蛋白提取液进行双向电泳,在13 cm pH 3~10（L）IPG胶条上可分离到（297±23）个重复性及分辨率均较好的蛋白质点,蛋白斑点的匹配率为83%。结论：HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化及图谱的建立,为进一步研究肝癌蛋白质组学奠定了基础。     

先天性巨结肠组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的 分析先天性巨结肠(HD)狭窄段及正常段肠管组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质.方法 采用固相pH梯度双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分离20例HD患者配对狭窄段及正常段肠管组织的总蛋白,银染显色,ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析差异表达的蛋白质点.结果 获得了重复性较好的2-DE银染图谱.图像分析显示,狭窄段和正常段肠管组织凝胶的平均匹配率分别为78.1%和86.7%.差异分析共获得103个差异表达的蛋白质点.结论 采用2-DE分离HD肠管组织的总蛋白可获得重复性较好的结果.获得的差异蛋白质点为寻找HD早期诊断的分子标记物提供了基础资料.     

HeLa细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立和优化HeLa细胞蛋白质组分析所需的样品处理方法和双向电泳技术.方法:用三种不同配方的裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质,进行双向凝胶电泳,用Amersham ImageMaster VDS-CL型凝胶成像系统获取凝胶图像,以PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析.结果:联合使用硫脲和尿素有利于蛋白质的提取,增加碱性蛋白点的检出数量;广谱蛋白酶抑制剂的使用可大大增加双向电泳可检出的蛋白点数,同时使可检出的碱性蛋白点明显增加.结论:本文建立了HeLa细胞双向电泳分析方法,提高了2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为其蛋白质组学进一步研究奠定了基础.     

循环酶法测定血浆同型半胱氨酸的方法学评价

目的：评价测定血浆同型半胱氨酸（HCY）的循环酶方法。方法：血浆氧化型同型半胱氨酸经三-乙-羧乙基膦（TCEP）还原成游离型HCY，基于HCY甲基转移酶（HMTase），S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHase）构成的循环酶体系以及脱氢酶-辅酶体系的原理，用自动生化分析仪测定血浆HCY。结果：测定线性范围达1．5μmol／L～50．0μmol／L：批内CV分别为2．1％、1．7％；日间CV分别为3．7％、4．1％，总CV分别为4．9％、5．2％；回收率96．8％-101．3％；本法和高效液相色谱法比较：R^2=0．9737，Y=0．972X＋1．595。t=2．01，P〉0．05，差异无显著性；血氨〈50．0μmol／L，三酰甘油〈11．0mmol／L，抗坏血酸〈10．0mmol／L，胆红素〈500．0μmol／L，血红蛋白〈2．0g／L，谷胱甘肽〈0．05mmol／L时，对结果无明显干扰。结论：本方法具有简便、灵敏等特点，适合血浆HCY的常规和自动化分析。     

大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系的建立

目的:建立大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系。方法:提取大鼠肾脏组织的样品蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化。结果:最终选择的裂解液配方是1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/LTris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;使用pH 4～7的IPG胶条进行被动水化上样,等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整;改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论:成功建立具有较高分辨率和重复性的大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系,为后续实验研究提供有力的技术保障。     

免网织红细胞乙酰转移酶的纯化及性质研究

Histone acetyltransferases from the ribosomes of rabbit reticulocytes were purified more than 100 fold. The procedures of purification included the following: acetyltransferases were released from ribosomes by 0.5 mol/L KCl treatment, then isolated by sedimentation through buffered sucrose containing 0.5 mol/L KCl. They were partially purified from the high salt washing fraction by sequential chromatography on histone-sepharose 4B, DEAE-cellulose 52 and phosphocellulose P11 columns and by nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Three main active bands were observed on 7.5% polyacrylamide gels under non-denaturing conditions with molecular weights of about 120,000, 70,000 and 40,000 respectively. The optimal pH for acetyltransferase activity was 7.5-8.0, and 1 mmol/L MgCl2 and 25 mmol/L KCl were required for activity. 70% of the activity was inhibited by 100 mmol/L MgCl2. The Michealis constants derived from double-reciprocal plots of the acetyltransferases for histone and acetyl coenzyme A were 1.2 mumol/L and 18-20 mumol/L respectively.     

大鼠青光眼慢性高眼压视网膜组织的二维凝胶电泳分析

目的应用二维凝胶电泳对SD大鼠青光眼慢性高眼压视网膜组织的蛋白进行初步分析.方法分离大鼠青光眼慢性高眼压视网膜组织,以对侧眼视网膜组织为对照,经样本初处理后,进行二维凝胶电泳和凝胶银染色,然后分析电泳图谱,观察蛋白的分离效果,对比、分析其表达蛋白质点的差异,寻找SD大鼠视网膜中与慢性高眼压相关的蛋白质.结果用化学裂解法结合超声波粉碎,可以裂解视网膜神经组织,使其大部分蛋白质得到溶解,成功建立对大鼠青光眼慢性高眼压眼及对照眼视网膜组织进行样本处理、二维凝胶电泳的基本方法和条件,得到两组视网膜组织的二维凝胶电泳图谱.各组织蛋白在小胶上均能显示120～290个左右的斑点.两组视网膜组织的凝胶图谱呈现出9个斑点的差异.结论二维凝胶电泳可以有效分离、显示视网膜特异表达蛋白质.通过双向电泳,我们发现SD大鼠视网膜蛋白质表达与对照眼相比有质和量的差异.     

双向凝胶电泳分析脾脏蛋白组学的方法研究

目的优化双向凝胶电泳的实验步骤,总结一套适用脾脏组织的双向凝胶电泳技术。方法对双向电泳实验中的关键环节：蛋白沉淀方法;胶条PH的选择;聚焦条件等进行研究与优化,考马斯亮蓝染色后进行凝胶图像比较。结果Cleaningup沉淀蛋白,聚焦电压达到11000伏小时（110kvhs）,可以得到多达1000个蛋白点的2Dgel（two—dimensionalpolyacrylamidegel）。结论建立了脾脏双向电泳的具体方法,得到分辨率高重复性好的2Dgel,为脾脏的蛋白质组学研究奠定了基础。     

集成毛细管电泳芯片分离尿蛋白条件的初步优化

目的:探讨集成毛细管电泳芯片快速分离尿蛋白条件的初步优化。方法:考察了分离电压(1200～2000V)、进样时间(10～30s)及乙胺浓度(0.5～2%(v/v))对尿蛋白分离的影响。结果:以75mmol/L pH10.3硼酸盐缓冲液含9.73μmol/L乳酸钙、1%(v/v)乙胺为电泳缓冲液,在以500V的进样电压进样15s、分离电压1500V条件下,电泳分离尿蛋白能分出更多蛋白峰。结论:通过优化可以有效地提高电泳芯片分离尿蛋白的效果。     

脑脊液双向电泳技术体系的建立

目的:建立用于脑脊液(CSF)蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找多发性硬化患者和对照组脑脊液蛋白质差异,从分子水平探讨多发性硬化患者脑脊液蛋白整体变化规律。方法:分别取对照组及多发性硬化患者的脑脊液,用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质后,加入适量裂解液使蛋白质充分裂解,离心后取上清液上样。进行第1向等电聚焦(IEF)电泳和第2向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),染色脱色后,分析所得蛋白质斑点。结果:对照组和多发性硬化患者脑脊液2-DE图谱上均可得到近200个蛋白质斑点,其中2个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量增加,4个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量减少,12个蛋白质斑点为多发性硬化患者脑脊液特有。结论:对照组和多发性硬化患者脑脊液的双向电泳图谱存在明显差别,这些发现可为研究多发性硬化疾病机制提供线索。     

H5N1亚型禽流感病毒NSl蛋白表达影响因素分析

目的 优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol／L,诱导温度为37℃,诱导表达6．0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以o．1mm01／L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0。6mmo1／L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4．0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Westernblotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0。3mmol／L时,融合蛋白GST-NSl在IPTG诱导5．0h时的表达量最高,达28．5％;当IPTG诱导浓度为0。6ram01／L,在37℃诱导表达4。0h时,融合蛋白的表达量可达27．9％。选用优化的表达条件,IPTG0．6mmo1／L,37℃诱导表达4．0h,融合蛋白的表达量最高可达33．2％。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25．1％。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。