大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因RNA干扰表达质粒构建与鉴定

目的 构建并筛选大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)基因的RNA干扰(RNAi)表达质粒,为职业性疾患的基因治疗探索新途径.方法 根据基因序列数据库中报道的PARP-1基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1 RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectamine TM2000介导转染大鼠骨髓间充质干细胞.48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染细胞中PARP-1 mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1 RNAi质粒.结果 4种重组PARP-1 RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确.转染后48 h,转染质粒shRNA-PARP-1-532的细胞PARP-1基因抑制效果最明显,mRNA的转录水平下降了78％,可作为后续实验的有效质粒.结论 成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为探索PARP-1基因在疾病中的作用奠定了基础.     

聚ADP核糖聚合酶1与DNA甲基化的关系及其可能的机制

聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶,主要存在于细胞核内,少量存在于细胞浆内[1],具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用.尽管目前PARP家族至少有18名成员,但研究表明,PARP-1活力占所有PARP蛋白活力的90％以上.PARP-1在绝大多数组织中为组成型表达,但受到DNA链断裂等损伤激活后,其活力会立即上升500倍以上[2-3].PARP-1是该家族中最重要的一员,具有保持染色体结构完整、参与DNA复制和转录的功能[4-6],在维持基因组稳定和细胞死亡及调控基因组的甲基化模式的过程中发挥着重要作用[7-9].     

携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的构建方法研究

目的 提高构建携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的成功率.方法 通过理论研究结合实验操作经验.结果 利用该方法可以高效率的成功构建真核表达载体.结论 文章提出的方法简便、通用、高效,可以解决重组DNA载体构建技术中的一系列关键问题,为相关研究提供了必要的理论和技术支持.     

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1多态性的检测

目的 检测人类聚腺苷二磷酸核糖聚合酶—1(PARP—1)5个外显子核苷酸多态性。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)—单链构象多态性(SSCP)和银染技术检测3个民族634名正常人PARP—1基因多态性。结果 在3个民族634名正常人血标本的5个外显子扩增产物SSCP电泳条带中，219名汉族人PARP—1基因5个外显子均未检出多态性条带；203名布依族和212名壮族人PARP—1基因的5个外显子扩增产物中分别有2例的外显子20的SSCP电泳条带检出1条多态性条带。其余4个外显子扩增产物SSCP电泳未见多态性条带。结论 PARP—1基因第20外显子上可能存在多态性。PCR—SSCP银染技术具有简便、高效、快速、重现性好等优点，是对大样本进行PARP—1基因突变筛检的一种有效的方法。可用于分子流行病学研究。     

NOB1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:构建针对NOB1基因的shRNA慢病毒载体,并在卵巢癌SKOV3细胞上鉴定其沉默效率,观察其对细胞增殖能力的影响。方法:将筛选的NOB1基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与pLVTHM慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3细胞;采用Real-timePCR和Westernblot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率,MTT和克隆形成实验观察NOB1基因沉默对SKOV3细胞增殖的作用。结果:构建的shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3细胞后,NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降73.5%,蛋白表达显著抑制,同时MTT实验显示细胞增殖能力显著降低,克隆形成实验表明细胞克隆形成能力明显减弱。结论:成功构建的NOB1基因shRNA慢病毒表达载体能够在卵巢癌SKOV3细胞上有效沉默靶基因,验证了NOB1基因具有影响卵巢癌细胞恶性增殖的能力。     

ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究

目的观察BHRF1 shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌CNE2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响,以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。方法利用RNAi技术将负载BHRF1 shRNA的质粒载体转染至人鼻咽癌CNE2细胞,一组为BHRF1 shRNA质粒载体转染过的CNE2细胞（观察组）,未进行转染的CNE2细胞确定为对照组,经RT-PCR扩增人鼻咽癌组织中BHRF1 cDNA片段,RT-PCR和Western blot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达。并且利用顺铂进行实验,观察使用顺铂后,BHRF1 shRNA转染后的肿瘤细胞是否对放射敏感性有变化。结果 BHRF1 shRNA转染鼻咽癌CNE2细胞后,细胞内BHRF1 mRNA表达量（2.02±0.53）,对照转染前明显下调,明显下调,与对照组的（29.82±0.64）比较,差异有显著性意义（P〈0.01）;DDP和8G放疗作用24 h以后,被转染的细胞的中的蛋白表达大大降低（P〈0.05）,癌细胞凋亡率上升,明显比对照组癌细胞的凋亡率高（P〈0.05）。结论利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值,BHRF1 shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达,而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。     

HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1（＋）载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系,G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建,为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。     

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抑制剂对氢醌致人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)特异性抑制剂N-(6-氧-5,6-二氢菲啶-2-羟基)-N,N-二甲基乙酰胺-盐酸(PJ34)对氢醌(HQ)所致人胚肺成纤维细胞(HLF细胞)凋亡的影响及其作用机制。方法将离体传代培养的HLF细胞分为阴性对照组、阳性对照组(HQ组)、3个PJ34组和3个PJ34 HQ组。按PJ34不同浓度(0.5、1.0、2.0μmol/L)分为PJ34的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,作用4 h后检测结果;按PJ34的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组浓度及作用4 h后再分别加入HQ(80μmol/L)分为PJ34 HQ的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,作用24 h检测结果;HQ组仅用HQ24 h处理。采用PARP-1单克隆抗体荧光标记,流式细胞术检测HLF细胞中PARP-1蛋白表达、细胞凋亡和细胞复制后期(G2)细胞数情况,噻唑蓝(MTT)比色法测定HLF细胞相对存活率。结果各组给予不同剂量的PJ34 4 h后,HLF细胞的存活(增殖)明显受抑制(P<0.05),随着PJ34浓度的增加,其抑制作用进一步增强;PARP-1蛋白表达阳性的HLF细胞百分数均明显低于阴性对照组(P<0.01);流式细胞术检测显示HQ作用24 h后均可引起HLF细胞的调亡,可出现明显的亚二倍体峰,且随着PJ34预处理浓度的增加,其峰值也逐渐增加;HQ可导致细胞周期出现G2期阻滞,PJ34 HQⅠ、Ⅱ、Ⅲ组G2期阻滞减少且差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。结论PARP-l抑制剂PJ34明显抑制HLF细胞PARP-1表达,增加HQ所致细胞凋亡,并通过诱导HLF细胞凋亡抑制其增殖。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

短发夹状RNA介导TNF-α基因沉默及抑制细胞凋亡的作用

目的探讨特异性的短发夹状RNA（shRNA）沉默肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因及抑制细胞凋亡的作用效果。方法构建针对大鼠TNF-α基因编码区的短发夹状RNA真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-TNF-αshRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达TNF-αshRNA的细胞系。实验分为3组,⑴正常对照组：未转染的RK3E细胞;⑵阴性对照组：转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;⑶实验组：转染TNF-αshRNA的RK3E细胞系。经脂多糖（LPS）孵育12h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达。结果成功构建大鼠TNF-α基因的短发夹状RNA真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-TNF-αshRNA;经LPS刺激后,与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低（P〈0.01）,TNF-α的mRNA含量显著降低（P〈0.05）。结论针对TNF-α的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的RK3E细胞凋亡。     

载体介导的人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向RNA干扰

目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞中的表达,为研究DNA聚合酶β在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备。方法利用分子克隆技术构建含pU6启动子的人DNA聚合酶β基因RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFP-C1-U6-dsRNA”;以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的DNA聚合酶β表达情况。结果在转染重组子的细胞中,DNA聚合酶β的表达明显下调,仅相当于正常细胞的17·3%。结论人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向抑制成功。     

RNA干扰抗艾滋病病毒感染研究进展

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种古老而保守的生物现象,它由21～23个核苷酸的双链RNA通过碱基互补靶向识别并降解mRNA,导致序列特异的基因沉默。体外证明小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)能对抗HIV-1感染。它主要作用于宿主细胞受体,如CD4或CCR5等相应的mRNA及HIV-1的mRNA,抑制病毒表达,阻抑病毒感染。RNAi有可能成为一种新的防治HIV-1感染的基因治疗方法。     

靶向HBx小干扰RNA表达载体构建及其功能探讨

目的:设计和构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx)特异性的小干扰RNA(siRNA)体内表达载体,筛选抑制X基因表达的有效siRNA,并初步探讨其对HBV复制功能的影响。方法:以X基因为目的基因,以产生siRNA质粒载体pSilencerTM-U6为表达模板,细胞内转录合成3条siRNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-HBx。将重组质粒载体plucF-HBx与产生siRNA的质粒pSilencerTM-U6共转染HepG2细胞,检测荧光素酶活性以筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA,逆转录聚合酶链反应检测HBx mRNA的表达,进一步证实siRNA对HBx表达的抑制效果,然后将siRNA转染HepG2.2.15,酶联免疫吸附法和荧光定量PCR检测siRNA对HBV复制的影响。结果:合成的3条siRNA中有1条抑制荧光素酶表达,抑制效率为76.3%,并能特异性抑制HBV的复制。结论:成功构建并筛选到针对X基因表达的有效siRNA质粒,为HBV的基因治疗奠定基础。     

RNA干扰技术沉默Livin基因联合顺铂对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的:采用RNA干扰技术阻断Livin基因的表达,并加入不同浓度的顺铂,研究其抑制Hela细胞Livin基因的效果及增强顺铂诱导宫颈癌细胞凋亡的效应。方法:采用脂质体转染法将pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72、pGenesil-1-HK转染宫颈癌Hela细胞,采用荧光定量RT-PCR、Western-blot检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因mRNA和蛋白表达的变化,并加入不同浓度的顺铂(3μg/ml、6μg/ml、9.9μg/ml),采用流式细胞术检测不同时间(24 h、48 h)的细胞凋亡率。结果:转染pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72后Hela细胞中Livin mRNA拷贝数明显减少,蛋白质表达水平显著降低;流式细胞术检测24h、48h凋亡率,干扰组细胞显著高于对照组,并随时间延长凋亡率增加;加入顺铂(3μg/ml、6μg/ml、9.9μg/ml)后流式细胞术检测24 h、48 h凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05),呈时间及剂量依赖性。结论:以Livin基因为靶向的RNA干扰技术可有效地抑制宫颈癌Hela细胞的Livin基因表达,并可增强顺铂诱导凋亡的效应,且具有时间和剂量依赖性。     

Smad3-siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建Smad3特异的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Smad3表达在肝纤维化治疗中的意义奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的Smad3基因核苷酸序列,选择设计能转录小发夹结构RNA(small hairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencer3.1-H1-hygro质粒载体连接,构建真核表达载体,使用限制性内切酶鉴定及测序鉴定是否为阳性克隆。结果成功构建pSilencer3.1-Smad3载体,拟进一步采用RNAi技术观察其对Smad3基因表达的抑制情况,从而研究其在肝纤维化治疗中的作用。结论 Smad3-siRNA真核表达载体被成功构建。     

靶向EZH2基因的shRNA干扰对人卵巢癌细胞Drosha基因表达的影响

目的:探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对卵巢癌细胞株A2780的Drosha基因表达的影响。方法:获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的人卵巢癌细胞株A2780-shEZH2,实时定量PCR法(qRT-PCR)和免疫印记法(Western blot)检测转染株的Drosha基因表达。结果:以未转染组A2780细胞Drosha的表达水平为100%,EZH2-shRNA转染组A2780-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.02±4.32)%和(51.26±1.35)%,与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论:沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体的构建

目的 构建人修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.方法 提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hMTHI基因cDNA保守序列，经pGEMT载体克隆后双酶切，将cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl，构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，并转染细胞。用Western-blot法检验载体抑制hMTH1蛋白表达的效率。结果 经RT-PCR获得423bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为hMTH1基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，测序后确证。该载体转染细胞后，可使hMTH1蛋白水平下降约46％。结论 成功构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.