鼠疫疫苗的临床应用及研究进展

鼠疫是一种烈性传染病,具有高度的传染性和致病性,免疫接种是预防鼠疫的重要措施之一.目前使用的鼠疫疫苗主要是减毒活疫苗,近期开展临床研究的疫苗主要是亚单位疫苗.本文就鼠疫减毒活疫苗的临床应用及鼠疫亚单位疫苗的临床研究进展作一综述,以期为新疫苗的研制提供参考.     

诊断用鼠疫噬菌体悬液制备方法的改进及其应用

<正>鼠疫噬菌体裂解试验是经典的鼠疫病原学诊断方法之一,也是鼠疫病原学"四步检验"中最主要的一项检验。在现行的鼠疫诊断标准中,仍将鼠疫噬菌体裂解试验的结果作为鼠疫菌的判定依据。在鼠疫诊断试验中所采用的特异性噬菌体为φA1122     

鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用纯化的鼠疫菌F1抗原作为包被抗原,HRP标记的F1抗原作为酶标抗原,建立鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、敏感性、特异性、准确性和稳定性验证。结果鼠疫菌F1抗原的最佳包被浓度为0.6μg/ml,HRP标记的F1抗原的最佳工作浓度为1︰7 000。制备的试剂盒检测精密性质控品的板内变异系数为6.5%,板间变异系数为7.1%;检测高、中、低浓度内部质控品和精密性质控品的回收率在95%¹12%之间;检测阳性血清和阴性血清的敏感性为100%;与正常人血清、正常兔血清、正常小鼠血清、兔抗假结核耶尔森菌血清、小鼠抗假结核耶尔森菌血清均无交叉反应;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,达到了体外诊断试剂的注册要求,可用于鼠疫的临床监测、诊断及预后判断。     

鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用鼠疫菌F1抗原免疫家兔制备抗血清,经50%饱和硫酸铵盐析2次后,再经Sephacryl S-300凝胶柱层析纯化,作为包被抗体;制备鼠疫菌F1抗原单克隆抗体腹水,并进行纯化,用HRP标记单抗,作为酶标抗体;建立鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、灵敏度、线性范围、特异性、重复性、准确性和稳定性验证。结果制备的试剂盒检测精密性参比品的板内变异系数为5.2%,板间变异系数为8.23%;试剂盒的线性范围为3.91⁶2.5 ng/ml,最低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54%62.5 ng/ml,最低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54%⁸.4%,回收率在104%8.4%,回收率在104%¹08%之间;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,为鼠疫的临床诊断及流行病学监测提供了一种快速检测手段,也为新型鼠疫组分疫苗F1抗原含量的检测提供了方法。     

甲型副伤寒沙门菌噬菌体的分离及其生物学特性的分析

目的分离甲型副伤寒沙门菌(副甲菌)噬菌体(副甲噬菌体),并分析其生物学特性。方法从昆明某医院污水中分离副甲噬菌体,并采用噬斑形成法检测其滴度;透射电镜下观察浓缩纯化后的副甲噬菌体形态;分析副甲噬菌体对不同pH(1~12)和不同温度(40、50、60、70、80℃)作用的敏感性;培养副甲菌和副甲噬菌体,以不同培养时间为横坐标,对应的噬菌体滴度为纵坐标,绘制一步生长曲线,并测定爆发量、最佳MOI及副甲菌突变率;提取副甲噬菌体基因组,酶切分析副甲噬菌体核酸,SDS-PAGE分析副甲噬菌体外壳蛋白;采用热酚法提取脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),采用苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)法提取外膜蛋白(outer membrane protein,OMP),初步分析副甲噬菌体的受体。结果在医院的污水中分离出的副甲噬菌体,经双层平板计数可见大小不一、透明的噬斑,滴度在109~1010 PFU之间,透射电镜观察可见长尾和一个头部;副甲噬菌体在pH值3~10之间滴度较高,40℃以上,随温度上升滴度明显降低,在80℃几乎无活性副甲噬菌体存在;副甲噬菌体感染潜伏期为20 min,爆发期为50 min,爆发量129,最佳MOI为0.2,副甲菌突变率为5.8×10-7~2.2×10-6;副甲噬菌体基因组的单酶切产物均可见33 bp的特异条带,SDS-PAGE分析可见4条主带;LPS、OMP能与副甲噬菌体结合,是副甲噬菌体的受体。结论副甲噬菌体为长尾噬菌体,基因组为dsDNA,大小为33 bp,最佳MOI为0.2,受体位点为LPS和OMP。     

噬菌体展示疫苗的研究进展

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒,因其固有的免疫原性、遗传可塑性、稳定性及安全性等优势,使其在疫苗研发中具有独特的潜力。目前,有较多利用其构建疫苗递送平台的研究,主要包括噬菌体展示疫苗、噬菌体DNA疫苗及杂交噬菌体DNA疫苗3种形式,其中研究最为广泛的是噬菌体展示疫苗。噬菌体展示技术是一种新型疫苗制备技术,是以噬菌体为载体,通过将外源多肽或蛋白基因整合至噬菌体基因中,以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的分子生物学技术。本文主要就噬菌体展示疫苗的免疫学基础、展示系统及其在疾病预防应用的研究进展作一综述,以期为噬菌体展示疫苗的研发与应用提供参考。     

噬菌体展示颗粒疫苗的研究进展

噬菌体是以细菌为宿主的病毒,具有严格的宿主特异性,只"寄生"在易感宿主菌体内,对动植物细胞无毒性。噬菌体结构简单,基因数少,是分子生物学与基因工程的良好操作系统。建立在噬菌体展示技术基础上的噬菌体颗粒,因其安全可靠,免疫效果好,在预防性和治疗性疫苗的研究中取得良好效果,表明噬菌体作为疫苗载体用于疫苗学的研究是一种新的发展方向,对新型疫苗的开发具有重要意义。本文就噬菌体颗粒用于疫苗研究的优势、研究进展及其应用前景作一综述。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体PhMASA-WJ的生物学特性及其对小鼠败血症的疗效

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)噬菌体PhMASA-WJ的生物学特性及其对小鼠败血症的疗效,为开发高效低毒的抗菌药物奠定实验基础。方法以MRSA(USA300)为宿主菌,从地下污水中分离筛选出1株噬菌体PhMASA-WJ,双层琼脂平板培养法测定噬菌体效价,点滴法测定噬菌体裂解谱,确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),提取噬菌体全基因组并进行酶切鉴定,电镜观察噬菌体形态,并检测噬菌体的体外裂解效果、安全性及其对小鼠败血症的疗效。结果 PhMASA-WJ在USA300菌苔上形成直径1～2 mm的圆形、透明且边界清晰的噬菌斑,PhMASA-WJ效价为7. 1×10⁸ PFU/m L,其为专一裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体,最佳MOI为0. 001,属于RNA病毒,基因组大小约23 000 bp。电镜观察显示,PhMASA-WJ属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。动物实验证实,PhMASA-WJ对小鼠无毒副作用,败血症小鼠经PhMASA-WJ...     

应用噬菌体法检测实验动物中的绿脓假单胞菌

作者应用噬菌体法检测实验动物中的绿脓假单胞菌,在453份动物粪便中查到绿脓菌148份(32.67%),其中包括77份 SPF 和 CL 小鼠粪便中查到17份(22.1%),206份 CV 小鼠粪便中查到79份(38.4%),20份 CV 家兔粪便中查到9份(45%),73份 CV 豚鼠粪便中查到13份(17.8%),77份 CV 仓鼠中查到30份(39%),而用培养法检出绿脓菌仅为12/453(2.65%)。结果表明噬菌体法检出率高,并具特异性高、方法简便、可靠的优点。     

噬菌体展示抗体库技术的研究进展

噬菌体展示抗体库技术是一种将抗体组合文库与噬菌体表面展示技术相结合所形成的新技术,可以将抗体分子展示在噬菌体表面,且保持了抗体的天然构象和生物学活性,为人源抗体的制备提供了良好的技术平台。本文对噬菌体展示抗体库技术的原理、特点、类型及其研究进展作一综述。     

新型牛蛙抗菌肽Temporin-La对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的治疗效果

目的探讨新型牛蛙抗菌肽Temporin-La对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的治疗效果。方法采用二倍稀释法检测抗菌肽Temporine-La对临床主要致病菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);透射电镜观察Temporine-La对金黄色葡萄球菌的作用效果;复制金黄色葡萄球菌表皮感染小鼠模型,分别用4 U/ml青霉素和10μg/ml Temporin-La进行治疗,另设生理盐水对照组和空白对照组,感染后第4天,对各组小鼠进行白细胞计数、细菌计数、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达水平检测及病理组织切片观察。结果Temporin-La对革兰阳性菌的抑菌活性高于革兰阴性菌,其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强;透射电镜观察显示,经100μg/ml Temporin-La处理的金黄色葡萄球菌出现了质壁分离的现象,细胞壁缺失或发生裂解,金黄色葡萄球菌发生裂解而死亡;感染后第4天,青霉素组和Temporin-La组白细胞数及创面下肌肉组织细菌数均明显低于生理盐水对照组(P<0.05或P<0.01),Temporin-La组小鼠血清VEGF的表达水平明显高于青霉素组和空白对照组(P<0.05),青霉素组和Temporin-La组小鼠的创口修复情况明显优于生理盐水对照组。结论 Temporin-La具有抗小鼠金黄色葡萄球菌感染的效果,为其临床应用提供了实验依据,也为抗感染治疗提供了新的思路。     

忍冬水提物对卵清蛋白致敏小鼠的疗效

目的研究忍冬水提物对卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠的疗效。方法建立OVA致敏小鼠模型,将OVA致敏BALB/c小鼠随机分为5组,即忍冬水提物高浓度组(H组)、中浓度组(M组)、低浓度组(L组)、模型对照组(CH组)及阴性对照组(NS组);采用小鼠足垫肿胀试验检测迟发型超敏反应;甲苯胺蓝及HE染色观察小鼠肠系膜、空肠肥大细胞及空肠绒毛上皮细胞形态;ELISA法检测小鼠血清OVA特异性IgE及IgG1、小肠黏液总IgA及OVA特异性IgA水平。结果 OVA致敏小鼠出现急性腹泻;致敏小鼠经足垫皮内激发,出现迟发型超敏反应;致敏小鼠肠系膜及空肠肥大细胞聚集、胞质颗粒外泄及空肠绒毛炎症细胞浸润;小鼠血清OVA特异性IgE及小肠黏液OVA特异性IgA水平明显升高(P均<0.01)。经H、M组忍冬水提物灌胃后致敏小鼠的一般状态、腹泻情况及空肠炎症明显缓解;OVA介导的足垫肿胀反应明显减弱;小鼠血清OVA特异性IgE及小肠黏液OVA特异性IgA水平明显降低(P均<0.01)。结论一定浓度忍冬水提物可有效缓解OVA致敏小鼠的速发型与迟发型超敏反应,其中高浓度金银花忍冬水提物效果较好。提示忍冬科植物中某些成分具有抗过敏作用。     

特异性杀伤肝癌细胞的噬菌体药物载体的构建

目的以T4噬菌体为载体,构建特异性杀伤肝癌细胞的噬菌体药物载体,并对其选择性细胞毒活性进行初步评价。方法通过噬菌体文库筛选肝癌细胞特异性结合肽(tumor specific peptide,TSP),利用分子克隆技术和噬菌体体外展示技术,将其与噬菌体小衣壳蛋白Soc重组,并展示在T4噬菌体表面。同时通过1-乙基(-3-二甲基氨基丙级基)碳酰二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC]化学法,将表阿霉素(epido-xorubicin,Epi)偶联在噬菌体衣壳表面,采用MTT法在细胞水平上检测噬菌体药物载体对人肝癌细胞Bel-7402和正常肝细胞HL-7702的选择性杀伤作用。结果 Soc-TSP融合蛋白以846拷贝/噬菌体颗粒的密度展示在T4噬菌体表面,Epi载药率达每个噬菌体颗粒表面近2 000个药物分子。与游离的Epi相比,构建的T4噬菌体药物载体对肝癌Bel-7402细胞的杀伤作用提高了4⁶倍,而对正常肝细胞HL-7702的影响不大。结论肿瘤特异噬菌体药物载体可提高药物对肿瘤细胞的靶向性以及肿瘤细胞对药物分子的摄入,从而实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。     

狂犬病抗血清在小鼠体内抗感染保护效果评价

目的探讨被动免疫的狂犬病抗血清和免疫球蛋白(Ig G)对小鼠的攻毒保护作用及其可能的作用机制。方法单独使用Ig G,按照125、250、1 000 IU/kg体重的剂量,分别在攻击致死剂量的强毒前后注射平均体重(20±1)g的昆明小鼠,观察14 d(脑内攻毒)或28 d(外周攻毒)后,记录小鼠发病及死亡情况,计算存活率。同时以类似的方法使用不同效价的抗血清进行试验。结果在攻毒前先注射Ig G或抗血清的条件下,小鼠的存活率与被动免疫的Ig G剂量呈正比,当Ig G剂量达1 000 IU/kg时,小鼠可得到完全保护;在脑内攻毒后注射Ig G或抗血清的条件下,无论被动免疫的Ig G剂量高低,均不能提供任何保护;但在外周攻毒3 d后注射Ig G,高剂量的Ig G可提供部分保护。结论血脑屏障可能允许部分Ig G进入脑内,并在脑内病毒感染早期阻断病毒复制,但病毒在脑内开始复制后,给予任何剂量的Ig G均不能对病毒感染提供保护。     

肝细胞移植治疗肝硬化的疗效

目的建立SD大鼠药物性肝硬化模型,探讨原代肝细胞移植治疗大鼠肝硬化的疗效。方法经四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCL4)诱导大鼠肝硬化模型,将40只模型大鼠分为2组,每组20只,Ⅰ组经脾尾注射约2×107个肝细胞,Ⅱ组经脾尾注射0.4 ml Hank’s液。观察每组大鼠的存活情况及肝功能变化;HE染色观察脾脏病理变化;免疫荧光观察植入的肝细胞在大鼠脾内合成白蛋白(Serum albumin level,ALB)的功能。结果经CCL4诱导10周后,大鼠肝脏经HE染色发现假小叶形成,表明成功建立了肝硬化模型;移植术后8周,Ⅰ组大鼠存活率(75%)显著高于Ⅱ组(35%),差异有统计学意义(P<0.01);Ⅰ组大鼠的血清ALB水平较Ⅱ组明显升高(P<0.05),血氨(Serum ammonia level,AMM)水平较Ⅱ组明显降低(P<0.05);Ⅰ组大鼠移植术后1、8周,大量肝细胞在脾脏红髓中定植下来;Ⅰ组大鼠移植术后5周,植入的肝细胞在大鼠脾内具有合成白蛋白的功能。结论 CCL4能稳定诱导肝硬化动物模型;同种异体肝细胞移植能提高肝硬化大鼠的生存率,并改善肝性脑病和低蛋白血症。     

腺苷A_(2B)受体激动剂Bay60-6583对脓毒症模型小鼠的治疗作用

目的研究腺苷A2B受体激动剂Bay60-6583对脓毒症模型小鼠的治疗作用。方法采用腹腔注射活金葡菌(108 CFU)制备小鼠脓毒症模型,观察Bay60-6583(2 mg/kg)、头孢曲松钠(25 mg/kg)单独或Bay60-6583与头孢曲松钠(2 mg/kg+25 mg/kg)联合给药对脓毒症模型小鼠的治疗效果,设正常对照组和感染组。采用ELISA试剂盒检测给药后小鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,并使用血球计数板计数小鼠腹腔灌洗液中白细胞数。结果 Bay60-6583和头孢曲松钠单独给药均降低脓毒症模型小鼠死亡率,但联合给药组几乎完全消除小鼠死亡,与感染组或单独给药组相比较,差异有统计学意义(P0.05);Bay60-6583单独或联合给药均明显降低小鼠血清中炎性细胞因子含量(P0.05),但不改变小鼠腹腔灌洗液中白细胞数(P0.05),而头孢曲松钠单独用药则略微降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量(P0.05)。结论 Bay60-6583通过抑制脓毒症小鼠炎性细胞因子表达发挥其治疗作用,与头孢曲松钠联合用药是合理的脓毒症治疗策略。     

Oxime-based click chemistry in the development of 3-isoxazolecarboxylic acid containing inhibitors of Yersinia pestis protein tyrosine phosphatase, YopH

The pathogenicity of Yersinia pestis relies on several effector proteins including YopH, a protein tyrosine phosphatase (PTP). We previously screened a library of analogues based on the ubiquitous PTP substrate para-nitrophenylphosphate (pNPP) and found that incorporation of a 3-phenyl substituent to give 6-nitro-[1,1'-biphenyl]-3-yldihydrogen phosphate (1) enhanced affinity. Herein we report the conversion of 1 from a substrate into an inhibitor by replacing the hydrolysable phosphoryl group with a 3-isoxazolecarboxylic acid moiety and by introduction of an aminooxy group and subsequent diversification using oxime-based click chemistry. This approach led to the identification of non-promiscuous bidentate YopH inhibitors with affinity in the low micromolar range.     

小鼠Sca-1^+干细胞对心肌梗死模型小鼠的疗效及其基因调控机制

目的探讨小鼠干细胞抗原-1阳性(stem cell antigen-1-positive,Sca-1^+)干细胞(stem cells,SCs)对心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型小鼠的疗效及其基因调控机制。方法采用免疫磁珠分选法急性分离2日龄及3、6、9、12月龄小鼠心脏Sca-1^+SCs;通过结扎8周龄小鼠心脏冠状动脉左主降支,建立小鼠急性MI模型,于心梗边缘区分别注射PBS和Sca-1^+SCs悬液。术后行超声心动图测定心功能,Masson三色染色、心重/体重比(HW/BW)用于评价各组Sca-1^+SCs对心脏结构的影响。将各组小鼠心脏Sca-1^+SCs进行全基因组测序,通过STEM软件对转录组基因表达水平进行聚类及GO富集分析,筛选出乳鼠和成年鼠差异表达的基因类型,并采用qRT-PCR法进一步验证目的基因的表达情况。结果 MI术后,与PBS组比较,乳鼠心脏Sca-1^+SCs治疗组小鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)均明显升高(P <0. 05),HW/BW明显降低(P <0. 05),左室舒张末内径(left ventricular diastolic internal diameter,LVIDd)明显减小(P <0. 05);与成年鼠比较,乳鼠心脏Sca-1^+SCs移植治疗可降低心肌梗死面积,缓解心腔扩大。在乳鼠心脏Sca-1^+SCs中高表达,而成年鼠表达降低的基因共185个,regulation of developmental process条目上富集基因有38个,其中肌球蛋白重链6(myosin heavy chain6 cardiac muscle alpha,Myh6)、胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,Igf2)、成骨细胞特异性因子(periostin,Postn)、神经元再生相关蛋白(neuronal regeneration related protein,Nrep)基因在乳鼠心脏Sca-1^+SCs中具有较高转录水平。与乳鼠比较,成年小鼠心脏Sca-1^+SCs中Myh6、Igf2、Postn、Nrep基因m RNA的表达水平均显著下调(P <0. 05)。结论乳鼠心脏Sca-1^+SCs移植对MI的疗效优于成年小鼠,其原因可能是乳鼠心脏Sca-1^+SCs中Myh6、Igf2、Postn、Nrep等基因的表达水平高于成年小鼠。     

自身免疫性溶血性贫血患者成分输血的疗效观察

目的探讨自身免疫性溶血性贫血(AHIA)患者成分输血的临床疗效。方法对15例输注洗涤红细胞的AHIA患者(A组)和15例输注红细胞悬液的AHIA患者(B组)的临床资料进行回顾性对比分析。结果 A、B两组患者输血24h后,血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)数量和血细胞比容(Hct)均升高;同组内输血前后比较,差异均有统计学意义;两组间输血前后差异均无统计学意义。A组中5例患者输注洗涤红细胞联合血浆置换治疗AHIA,临床症状明显改善。结论输注洗涤红细胞与红细胞悬液治疗AHIA,其临床效果差异无统计学意义;输注洗涤红细胞联合血浆置换治疗AHIA效果显著。