香榧性别鉴定的RAPD和SCAR标记

为了对香榧幼苗进行早期的性别鉴定,利用RAPD标记技术对香榧品种中的雌性和雄性群体进行了分析。在300条RAPD随机引物中,用引物S250扩增得到了1条大约600bp雄性特异性片段,将其命名为S250-600。进一步对该RAPD标记片段进行回收、克隆和测序,获得了593bp的该标记的核苷酸特定序列。根据对该片段的序列分析结果,设计了1对引物,成功地将RAPD标记转化为SCAR标记,命名为SW-593。将该序列递交至GenBank数据库,接收号为:EU670673。利用该SCAR标记对香榧的雌性和雄性个体进行性别鉴定,结果表明,该SCAR标记在雄性个体中均能稳定出现,说明此SCAR标记是一个与香榧雄性基因连锁的标记,可以用来对香榧品种进行大规模的性别鉴定。     

猕猴桃性别分子标记在软枣猕猴桃中的通用性验证

【目的】猕猴桃是功能性的雌雄异株植物,在育种过程中进行实生苗早期性别鉴定研究具有重要意义。目前已有关于猕猴桃属植物早期性别鉴定分子标记开发的报道,用于特定种群实生苗童期的性别鉴定。验证这些标记在其他来源种质资源中的通用性可扩大这些标记在猕猴桃属植物中的应用范围。【方法】利用已知性别的64份软枣猕猴桃材料,采用普通PCR扩增的方法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对已报道的两组猕猴桃性别分子标记A001、A002和A003,SmX和SmY1的通用性进行检验。【结果】(1) A001和A002在软枣猕猴桃中均能扩增出多态性片段,且条带清晰明亮,但未出现性别特异片段;(2) A003的PCR扩增结果凝胶图像中,没有清晰的片段出现;(3)在对已知性别的软枣猕猴桃资源的验证试验中,SmX的扩增结果图片显示,所扩增的条带未表现出雌雄特异性,准确率很低,且条带微弱;(4) SmY1在软枣猕猴桃中能够扩增出多态性片段,但未出现性别特异的片段。【结论】在本研究所用的软枣猕猴桃种质资源中,两组标记均未表现出良好的通用性,其性别扩增结果的雌雄鉴别率很低,甚至不能扩增出清晰的片段,故不能用于本研究所用软枣猕猴桃种质资源的性别鉴定。     

45S rDNA-FISH鉴定银杏雌雄性别

 植物中核糖体基因主要位于染色体次缢痕的核仁组织区（NOR），NOR的数目与随体染色体数目相对应。以核糖体基因（45SrDNA）为探针，对明确的雌株和雄株银杏中期、间期细胞进行荧光原位杂交（FISH）。结果显示雌株有4个杂交点，雄株有3个杂交点，表明雌性银杏具有4条带随体的染色体，而雄性银杏具有3条带随体的染色体。进一步证明银杏的雌雄性别决定与随体染色体数目有关。     

中国甜柿‘鄂柿1号’偶开雄花现象及其杂交后代早期鉴定

【目的】绝大多数柿品种仅开雌花,但中国甜柿‘鄂柿1号’可偶尔开雄花,探讨该现象与DNA变异有无关系及其育种学意义。【方法】利用荧光AFLP技术探讨‘鄂柿1号’雄花枝梢与其母株间的基因组是否存在变异;通过检测其花粉生物学特性以及F1是否存在与中国甜柿自然脱涩连锁的RO2标记和与雄性性别紧密连锁的Dl Sx-AF4S标记,探讨其作为中国甜柿育种亲本的可能性。【结果】(1)AFLP分析表明已知遗传关系的‘前川次郎’和‘次郎’(前者为后者的早熟芽变类型)的相似系数0.88,而‘鄂柿1号’雄枝与母株的相似系数为1.00,说明‘鄂柿1号’偶开雄花性状可能与DNA序列变异无关;(2)‘鄂柿1号’雄枝花粉离体萌发率较低,但其与‘太秋’和‘早秋’柱头亲和性较强;(3)‘鄂柿1号’作父本与‘太秋’和‘早秋’杂交,以及作母本与‘太秋’杂交,均可获得携带RO2标记的F1代单株,且在其作父本的部分F1代单株中检测不到Dl Sx-AF4S标记。【结论】‘鄂柿1号’偶开雄花现象可能不涉及遗传物质DNA序列的改变,其变异原因有待进一步探讨;其作杂交父本时F1单株中均携带与中国甜柿自然脱涩性状连锁的RO2标记,且部分单株不含与雄性性状连锁的Dl Sx-AF4S标记,说明其在选育仅开雌花的完全甜柿新品种中具应用潜力。     

柿野生雄性资源调查及其遗传多样性研究

柿（Diospyros kaki Thunb.）雄性种质资源非常稀缺,系统收集和梳理国内外现有雄性资源,阐明其遗传多样性并揭示其与主栽甜、涩柿品种及近缘种的亲缘关系,对雄性种质资源的高效利用有重要意义。在全国范围内开展柿野生种质资源调查,在湖北、广西、江苏等地发现野生雄性种质资源共计90余份。利用15对SSR引物对47份柿完全雄性资源、2份雄全同株资源和11份中国雌雄同株资源进行遗传多样性分析,以67份完全雌性资源、38份日本资源（其中包括25份雌雄同株资源）以及28份近缘种为对照。结果表明：15对引物共获得144个等位基因和316个基因型,平均每个引物获得9.60个等位基因和21.07个基因型,其中位点ssrDK11/DQ097479 遗传变异程度最高。从地理分布来看,柿雄性资源在适生的野外山区普遍存在,其中湖北木兰山来源的雄性资源遗传多样性最高,陕西省来源的雄性资源遗传多样性最低。UPGMA和ME聚类方法分别将193份资源分为16组和12组,两种聚类结果反映的总体规律类似：（1）各来源地间的野生雄性资源存在着一定程度的遗传隔离;（2）湖北木兰山野生雄性资源被分为遗传关系较远的两类,一类与江西、江苏、湖南野柿及‘火晶’等主栽涩柿品种和‘耀县五花柿’等雌雄同株涩柿品种亲缘关系较近,另一类与云架山雄性资源和罗田甜柿（包括‘甜宝盖’）亲缘关系较近;（3）大部分日本来源的柿资源可被单独聚为一类。     

基于SCoT与IRAP标记的金枣柿实生后代遗传变异分析及其生殖特性

【目的】金枣柿是浙江重要经济果树之一,其果实有无核与有核之分,在雄花未见的情况下,其后代遗传变异情况及生殖特性有待探讨。【方法】以金枣柿母本一的15个子代及母本二的16个子代为研究群体,以来自浙江不同地区的12个金枣柿单株及柿(Diospyros kaki)、君迁子(D.lotus)、山柿(D.japonica)为对照;采用SCo T和IRAP分子标记技术,分析金枣柿实生后代的遗传变异情况,并以此推测其种子来源。【结果】利用筛选出的21条SCoT引物及20条IRAP引物对供试材料基因组DNA的扩增结果表明,2种标记共扩增出473条清晰、可重复谱带,其中多态性谱带454条;2种标记的多态性比例分别为93.56%和97.50%。2个子代群体均产生了遗传分离。群体1通过SCo T和IRAP标记得到的DICE相似系数变异分别为0.637~1.000和0.927~1.000,群体2利用这2种标记得到的DICE相似系数变异分别为0.987~1.000和0.981~1.000。【结论】金枣柿的实生群体中均存在一定程度的遗传变异,其中群体1的DICE变异系数虽低于群体2,但其变异主要集中于个别单株,群体2单株的变异类型比群体1更丰富。金枣柿的种子主要由有性杂交产生,其花粉供体很可能为同种的雄花,不排除其具有兼性无融合生殖的能力。     

基于SCoT与IRAP标记的金枣柿实生后代遗传变异分析及其生殖特性北大核心CSCD

【目的】金枣柿是浙江重要经济果树之一,其果实有无核与有核之分,在雄花未见的情况下,其后代遗传变异情况及生殖特性有待探讨。【方法】以金枣柿母本一的15个子代及母本二的16个子代为研究群体,以来自浙江不同地区的12个金枣柿单株及柿(Diospyros kaki)、君迁子(D.lotus)、山柿(D.japonica)为对照;采用SCo T和IRAP分子标记技术,分析金枣柿实生后代的遗传变异情况,并以此推测其种子来源。【结果】利用筛选出的21条SCoT引物及20条IRAP引物对供试材料基因组DNA的扩增结果表明,2种标记共扩增出473条清晰、可重复谱带,其中多态性谱带454条;2种标记的多态性比例分别为93.56%和97.50%。2个子代群体均产生了遗传分离。群体1通过SCo T和IRAP标记得到的DICE相似系数变异分别为0.637~1.000和0.927~1.000,群体2利用这2种标记得到的DICE相似系数变异分别为0.987~1.000和0.981~1.000。【结论】金枣柿的实生群体中均存在一定程度的遗传变异,其中群体1的DICE变异系数虽低于群体2,但其变异主要集中于个别单株,群体2单株的变异类型比群体1更丰富。金枣柿的种子主要由有性杂交产生,其花粉供体很可能为同种的雄花,不排除其具有兼性无融合生殖的能力。     

几种新型DNA分子标记及其在食用菌研究中的应用

综述了新型分子标记SCAR、ISSR、SRAP和TRAP的原理与特点，以及这些技术在食用菌研究中的应用现状和前景。     

菜豆抗炭疽病基因SCAR标记在品种抗性鉴定中的应用

 利用5个来自于普通菜豆抗炭疽病基因SCAR 标记（SCA₁₀₀₀、SH18₁₁₀₀、SAB3₄₀₀、SB12₃₅₀和SCF10₁₀₇₂）引物组,对143份荚用菜豆资源进行DNA水平的鉴定。同时使用苗期接种方法,验证了143份资源的抗病性。结果表明：共有61份资源检测到SCAR标记。在这些资源中,有40份具有SCA₁₀₀₀标记,40份具有SCF10₁₀₇₂标记,19份兼有SCA₁₀₀₀和SCF10₁₀₇₂标记,其余的82份未检测到SCAR标记。这143份资源中均未检测到SAB3₄₀₀、SB12₃₅₀和SH18₁₁₀₀扩增带。群体抗性鉴定结果显示：143份资源中,抗病的有16份。其中含有2个SCAR标记,群体抗性结果表现抗病的有5份,含有1个SCAR标记,并且群体抗性结果表现抗病的有3份。通过本研究明确了：荚用菜豆中Co-2和Co-10基因含量比较丰富,除扁圆荚类型紫荚菜豆中Co-2基因含量多于Co-10基因外,这两个抗病基因在其它类型的菜豆中分布比较均匀。在油豆类型和扁圆荚类型绿荚菜豆资源中,同时含有此两个抗病基因标记的较多。在油豆类型资源中,含有两个抗病标记,并且群体抗性表现抗病的最多。     

ISTR在部分柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中的应用

 利用反向序列标签重复技术( inverse sequence-tagged repeat, ISTR) , 对柿属7个种, 包括柿(Diospyros kaki Thunb. ) 、君迁子(D. lotus L. ) 、浙江柿(D. glaucifolia Metc. ) 、油柿(D. oleifera Cheng. ) 、金枣柿(D. sp. ) 、老鸦柿(D. rhombifolia Hemsl. ) 和美洲柿(D. virginiana L. ) 共32个基因型进行了种质鉴定和亲缘关系研究。结果表明: ISTR可区分供试柿属植物中的30份; ISTR能够很好地适用于柿属植物亲缘关系分析; 供试的中国与日本原产柿种质分别聚类; 新发现的中国甜柿变异类型与日本甜柿的亲缘关系较远且存在较丰富的遗传变异, 可能是潜在的育种资源。ISTR标记可在柿属植物种质资源鉴定和亲缘关系分析中更广泛地应用。     

柿树乙醇脱氢酶活性与可溶性单宁含量的关系

研究了4种不同脱涩类型柿(Diospyros kaki Thunb)果实和叶片中的可溶性单宁含量、乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase, ADH）活性和ADH最适反应温度,以了解ADH在脱涩过程中的作用。结果表明：不完全甜柿和完全甜柿果实发育前期,可溶性单宁含量逐渐降低,ADH活性逐渐增高,到果实基本完成脱涩后,ADH活性又开始降低,在不完全甜柿中变化较大;涩柿和不完全涩柿在果实近熟期,可溶性单宁含量有所下降,但不能完成脱涩,且ADH活性较低。叶片发育过程中,可溶性单宁含量的变化与ADH没有相关性。乙醇脱氢酶的最适反应温度在25℃左右。ADH与柿果实脱涩有一定关系。     

1-甲基环丙烯对‘富有’甜柿采后主要生理指标及细胞超微结构的影响

 以完全甜柿‘富有’ (Diospyros kaki L.‘Fuyu’) 为试材, 研究了在室温(20 ±2) ℃贮藏条件下1 - 甲基环丙烯(1-MCP) 0.50 μL·L^-1处理对果实的影响。结果表明: 1-MCP处理可显著抑制其呼吸速率、乙烯释放速率和衰老软化进程; 12MCP处理通过抑制果实中LOX活性的升高和MDA含量的积累,一定程度上维持了果肉细胞器和膜系统的完整性, 延缓甜柿果实的软化衰老进程。     

柿果实采后软化中PG酶活性及其基因DkPG1的表达

为了进一步探索多聚半乳糖醛酸酶（PG）在柿（Diospyros kaki L.）采后软化中的分子调控机制,应用实时荧光定量PCR技术和DNS比色法检测常温下丙烯和1–甲基环丙烯（1-MCP）处理‘富平尖柿’果实中PG基因DkPG1的表达量和PG酶活性的变化。结果显示,随着柿果实成熟软化,DkPG1基因转录水平呈先上升后下降的趋势,其中丙烯处理4 d出现表达高峰,比对照提前12 d且峰值极显著高于对照,而1-MCP处理的果实中的表达高峰出现在处理后28 d,比对照推迟12 d峰值极显著低于对照。丙烯处理果实PG酶活性迅速增加,活性峰与DkPG1表达高峰出现在同一天,1-MCP处理的果实PG酶活性明显降低,活性峰出现在DkPG1表达高峰前4 d。此外,对不同处理下乙烯释放量和果胶组分变化分析的结果显示DkPG1基因的表达受乙烯调控,进而影响果胶组分代谢。     

广西西北部高原地区柿种质资源调查及遗传多样性分析

 调查和研究了广西西北部云贵高原地区柿种质资源状况,并对收集到的柿种质进行表型系统聚类和SCoT遗传多样性分析。结果表明,广西西北部云贵高原地区柿种质资源较丰富,至少拥有柿、油柿和野柿3个种31个不同品种和类型,部分地方仍保存有原始的野生种。不同柿种质在形态和DNA水平上都表现出很大的变异,具有丰富的多样性。35个相对独立的表型性状被用于柿种质的Q型系统聚类分析,在欧氏距离D = 9.8处,31份种质被分为5组,与果形及种质类型在一定程度上相吻合。13条SCoT多态性引物可从31份柿种质中扩增出161个DNA位点,多态性带比例为95.65%;UPGMA聚类分析显示,SCoT标记能将31份柿种质完全区分开,在相似系数0.686的水平将其分为5大类,与表型分析结果基本一致。     

罗田甜柿Ty1-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列的分离和特性分析

逆转座子序列信息的获得,对了解其在基因组中的行为及系统学研究有重要价值。本试验从罗田甜柿（Diospyros kaki Thunb. 'Luotian-tianshi'）基因组中分离31个RNaseH-LTR（Long Terminal Repeat,长末端重复）序列,并利用IRAP（Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism,逆转座子间扩增多态性）技术对部分序列相应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行初步探讨。序列分析结果表明,至少有10个Ty1-copia类逆转座子家族得到扩增;其家族间普遍表现高度异质,碱基替换、插入或缺失突变,以及翻译成氨基酸后发生不同程度的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等,是产生高异质性的原因;此外,其家族内部某些序列间的相似性极高,可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现。应用部分逆转座子引物的IRAP分析结果表明,相应的逆转座子家族在柿属植物中普遍存在,其分布广泛,拷贝数高,转座活性强,具有进一步开发为多种逆转座子分子标记的潜力。     

一个用于甘蓝显性雄性不育基因转育辅助选择的SCAR标记

一个与甘蓝显性雄性不育基因连锁的ＲＡＰＤ标记ＯＴＩＩ９００被转化为显性的ＳＣＡＲ（Ｓequence Characterized Amplified Region) 标记STII900,它可用于甘薯显性雄性不育基因转育辅助选择。     

山葡萄雄株花蕾性别转换的形态观察及其内源激素的变化

以山葡萄雄株为试材,花前20d用100mg/L的KT-30S处理雄株花序,以蒸馏水处理为对照,观察处理后的形态变化和坐果情况,并在不同处理时期取样测定内源激素含量,探讨外源细胞分裂素KT-30S对山葡萄雄株花蕾性别转换的效果及其对内源激素的影响。结果表明:KT-30S对山葡萄雄株的性反转效果显著,雄花花蕾在处理6d子房显著膨大。经KT-30S处理,4种内源激素含量和平衡关系表现出不同的变化趋势,由此推断,KT-30S诱导山葡萄雄株性反转可能是通过调节内源激素在不同时期的水平及其之间的平衡关系来实现的。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

山葡萄性别相关AFLP标记筛选及SCAR标记转化

通过AFLP分子标记方法,应用64对引物组合EcoR Ⅰ-NNN/Mse Ⅰ-NNN对山葡萄雌花、雄花和两性花植株基因池进行筛选,引物E-AGC/M-CTG在雄花和两性花植株基因池DNA中扩增出一条分子量为283 bp的特异性条带;经组池个体和其它品系验证,该特异性条带能在雄株和完全植株中稳定出现.将该特异性条带回收、克隆、测序,设计SCAR标记引物,对已知性别的85份山葡萄种质进行盲测,准确率达到97.6%,表明标记转化成功.由于该SCAR标记在绝大多数山葡萄栽培品种和有育种价值的种质资源中得到验证,可利用该SCAR标记对山葡萄杂交后代在苗期进行性别鉴定,提高育种效率.     

大白菜隐性细胞核雄性不育恢复基因BrMsf3的标记

对一大白菜隐性细胞核雄性不育系454AB的恢复基因BrMsf3进行了SRAP标记,构建包含320个单株的分离群体,筛选SRAP标记1 128个,筛选出与恢复基因BrMsf3连锁的2个标记BMe10SA4和M52K2,与恢复基因BrMsf3的遗传距离为4.35 cM和7.74 cM。