苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建

将苜蓿花叶病毒中国分离株（Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，AlMV-Ch）的复制酶P2亚基（90KD蛋白）基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROK Ⅱ中，得到重组植物表达载体pAlMV-FL．     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

苜蓿花叶病毒RNA23''''端cDNA转基因烟草的研究

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV—Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKⅡ中，用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，采用叶圆片法转化普通烟草，诱导再生小植株．经卡那霉素抗性筛选和PCR检测，证明AIMV RNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．     

复制酶基因介导的抗病毒烟草植株的研究

将构建的携带烟草花叶病毒（ＴＭＶ）５４ＫＤ蛋白基因及黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）３’端缺失０．９Ｋｂ的１．６Ｋｂ片断复制酶基因植物表达载体ｐＢＩＣＴ，导入根癌农杆菌３１１ＳＥ系，用叶圆盘法转化烟草，在含有卡那霉素的选择性培养基上诱导生芽、生根，得到２８株成活苗．移入大田后，随机挑选４．株植物，提取植物总ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测，结果４株植物中都有复制酶基因的整合，而未经转化的对照组植物则没有．转基因植株在大田试验中表现了良好的抗烟草花叶病毒及黄瓜花叶病毒能力．     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体P^Bin438经HindⅡ和EcoPⅠ双酶切,回收其HindⅡ－BmaHⅠ-Sal-EcoRⅠ片段和P^UC19HⅢ-EcoRI片段连接,构建成载体记为P^UC38。将含AFP基因的克隆经BamHI,XhoⅠ双酶切,得到的BamHI-AFP-XhoⅠ片段装入P^UC38BanHI-SalⅠ位点,克隆AFP基因。然后再用HindⅢ、EoR1双酶切AFP基因,插入P^Uin438的HindⅢ-EcoRⅠ位点,进而构建成带有AFP基因的植物表达载体,为进一步研究AFP基因在植物中表达奠定了基础。     

商陆抗病毒蛋白cDNA的植物表达载体构建及转化烟草的研究

以商陆抗病毒蛋白的cDNA序列为依据,设计特异性引物,应用PCR技术扩增出5′端含有BamHI,3′端含有KpnI限制性内切酶酶切位点的目的片段,且在序列的开始和结尾分别加入起始密码子ATG和终止密码子TAA,将该目的片段定向克隆于载体pROKII中与CaMV35S启动子和Nos末端构成植物表达载体pRPAP,通过菌落直接PCR法和酶切分析鉴定出阳性重组子,用直接导入法将其导入农杆菌EHA105,以此作为工程菌进行烟草转化,对筛选到的阳性植株随机取样进行Southern印迹分析,结果表明,PAP基因已经整合到烟草基因组中,证明载体构建成功。     

乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建

报道了将乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ２）基因分别插入植物表达载体ｐＲｏＫⅡ的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子下游,构建为重组质粒ｐＲＨＢ和ｐＲＰ,并将其分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中。     

蝴蝶兰ACC氧化酶cDNA片段的克隆及其反义植物表达载体的构建

根据已报道的蝴蝶兰ACC氧化酶的基因序列,设计了一对引物,通过RT—PCR从蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC氧化酶的cDNA片段,将其连接到pMD19-T载体上进行测序．结果显示,该片段与参考的已报道序列具有99．70％的同源性．测序后将该基因的cDNA序列反向插入pBI221的CaMV35S启动子和nos terminator之间,构建了蝴蝶兰ACC氧化酶的反义基因植物表达载体,为进一步转化蝴蝶兰研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础．     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

番木瓜环斑病毒复制酶基因的克隆和序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＰＲＶ－ＡＬ中分离到复制酶（ＲＰ）基因，将基因克隆进载体ｐＵＣ１８，用双脱氧链终止法测定了基因序列，表明其全长为１６０２ｂｐ，与国内外报道的ＨＡ５－１、ＹＫ和Ｓｍ的ＲＰ基因相比，同源性分别达８２．８０％，９５．０７％和９１．８３％．